本文選題：間充質(zhì)干細(xì)胞 + 復(fù)發(fā)性實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎��； 參考：《天津醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：目的自身免疫性葡萄膜炎是一大類眼部炎癥為主的疾病,累及的范圍可包括:葡萄膜、視網(wǎng)膜、視網(wǎng)膜血管以及玻璃體。該病多發(fā)生于中青年,分類繁多、易于復(fù)發(fā)。傳統(tǒng)的治療藥物包括糖皮質(zhì)激素以及一些免疫抑制劑。但由于長期使用可導(dǎo)致全身和局部嚴(yán)重并發(fā)癥,安全有效的新型治療方法亟需開發(fā)。本實(shí)驗(yàn)室既往研究顯示在復(fù)發(fā)性實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎(recurrent experimental autoimmune uveitis,r EAU)大鼠模型的疾病早期,通過靜脈注射間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)可有效防止疾病進(jìn)展。盡管多項(xiàng)臨床實(shí)驗(yàn)證明MSCs治療在有廣泛臨床轉(zhuǎn)化前景,但在合理治療方案方面仍缺乏標(biāo)準(zhǔn)化路徑,需要更多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。在本實(shí)驗(yàn)中,我們試圖通過r EAU動物模型,觀察MSCs在疾病晚期的治療效果,為臨床治療提供理論基礎(chǔ)。方法1.貼壁法培養(yǎng)Wistar大鼠骨髓MSCs,隨后分離及鑒定。2.建立Lewis大鼠r EAU模型:首先行單側(cè)后肢足墊皮下注射混合抗原主動免疫Lewis大鼠制造EAU模型:光感受器間維生素A類結(jié)合蛋白(photoreceptor retinoid binding protein,IRBP)的多肽片段R16;結(jié)核桿菌素以及完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant,CFA)等量體積進(jìn)行充分地混合與乳化。免疫后10天收集EAU大鼠淋巴結(jié)及脾臟制成T淋巴細(xì)胞單細(xì)胞懸液,經(jīng)過射線處理作為抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cells,APC)與T細(xì)胞在R16的刺激下共培養(yǎng)48小時(shí)后,收集激活的T細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注射Lewis大鼠體內(nèi)建立r EAU模型。3.利用MSCs進(jìn)行治療:免疫后的大鼠行尾靜脈注射5*106MSCs細(xì)胞懸浮液1ml/天,連續(xù)3天進(jìn)行治療,對照組行等體積PBS注射,連續(xù)3天。分為早期治療組(第4天開始治療),晚期治療組(第20天開始治療),重復(fù)治療組(第4天及第20天均治療)。4.r EAU臨床評分:采用臨床上的裂隙燈來觀察EAU大鼠眼部前房炎癥反應(yīng),每天記錄評分至過繼免疫后40天,根據(jù)發(fā)病次數(shù)及炎癥程度采用Caspi臨床評分分為0-4等級。5.r EAU病理評分:過繼免疫40天后,將大鼠處死并取雙側(cè)眼球制備視網(wǎng)膜組織切片行HE染色后觀察病理學(xué)改變。并將組織病理學(xué)改變進(jìn)行評分分為0-4等級,0為無病理性變化,4為嚴(yán)重病理性改變。并且利用視網(wǎng)膜全層級外核層厚度來進(jìn)行視網(wǎng)膜損害的評價(jià)。6.視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram,ERG)記錄:利用記錄過繼免疫后第10、15、20、25、30、35、40天的暗適應(yīng)后的ERG結(jié)果來評定大鼠視網(wǎng)膜功能。7.光學(xué)相干斷層掃描(Optical coherence tomography,OCT):過繼免疫40天后,利用海德堡HRA+OCT系統(tǒng)對視網(wǎng)膜進(jìn)行斷層掃描并評分0-4等級來評價(jià)治療組及對照組的差別。8.免疫組織化學(xué)染色:取上述制備好的視網(wǎng)膜組織切片,利用免疫組化SP法來檢測各個(gè)不同分組視網(wǎng)膜中膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和視紫紅質(zhì)(rhodopsin,RHO)的表達(dá)。結(jié)果1.成功培養(yǎng),傳代純化并鑒定大鼠MSCs。2.大鼠r EAU模型的成功建立。3.前房炎癥反應(yīng)一直觀察至過繼免疫后40天。與對照組相比,早期治療組和重復(fù)治療組中眼內(nèi)炎癥臨床評分達(dá)高峰的次數(shù)及平均評分均明顯降低,但晚期治療組只降低了平均評分并未減少疾病復(fù)發(fā)的次數(shù)。4.組織病理顯示MSC治療組相比較于模型對照組,明顯減低了組織病理學(xué)評分,視網(wǎng)膜全層及外核層的厚度增加。但早期治療組與重復(fù)治療組之間并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。5.ERG顯示MSC治療組在疾病晚期階段檢測指標(biāo)暗適應(yīng)的0.01a/b波和3.0a波治療組振幅均明顯高于對照組。其他指標(biāo)也顯示此趨勢,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。6.OCT顯示MSC治療組相比較于對照組,有更好的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu),玻璃體腔內(nèi)有較少的炎性細(xì)胞(高反射點(diǎn)),視網(wǎng)膜層間較少炎性細(xì)胞(高反射團(tuán)塊)。7.所有MSC治療組,包括晚期治療組均減少了GFAP的表達(dá),早期治療組RHO表達(dá)量接近于正常,晚期治療組的RHO表達(dá)量仍高于模型對照組。結(jié)論早期采用MSC治療r EAU臨床治療效果顯著,在疾病晚期進(jìn)行治療也可有效阻止視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能的損壞。間隔較長的重復(fù)治療比單次治療更有效。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R773

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本文編號：1750046