本文選題：膜聯(lián)蛋白A2　切入點：氧誘導(dǎo)　出處：《青島大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：目的通過觀察ANXA2在體外高糖培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)及氧誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠視網(wǎng)膜新生血管中的表達,研究ANXA2對HUVEC增殖,遷移,成管能力的影響,對小鼠視網(wǎng)膜新生血管發(fā)育的影響,以及對新生血管相關(guān)因子表達的調(diào)控,探討ANXA2在視網(wǎng)膜新生血管形成過程中的作用和機制。 方法 (1)體外實驗應(yīng)用HUVEC細胞,實驗分四組：正常組(Normal,常規(guī)培養(yǎng)),高糖培養(yǎng)下的高糖對照組(Mock,無處理)、陰性干擾組(SiControl)、陽性干擾組(SiANXA2)。應(yīng)用Real-time PCR和Western blot方法檢測各實驗組HUVEC中膜聯(lián)蛋白A2 (ANXA2)基因及蛋白的表達情況,MTT方法檢測各組0h,24h,48h和72h細胞增殖能力,劃痕實驗觀察各實驗組細胞遷移能力,成管實驗評估細胞的成管能力。并通過Real-time PCR檢測各實驗組中新生血管相關(guān)因子VEGFA,MMP2,MMP9,TIMP2的mRNA表達情況。 (2)體內(nèi)實驗應(yīng)用C57BL/6J小鼠。小鼠出生后7天,放入氧濃度75-80%氧箱內(nèi)5天后取出正常環(huán)境下飼養(yǎng),構(gòu)建氧誘導(dǎo)(OIR)小鼠模型。實驗分四組：正常組(Normal,正常飼養(yǎng)),OIR空白對照組(Mock,無處理),OIR陰性干擾組(SiANXA2_M)、和OIR陽性干擾組(SiANXA2)。分別取正常組和OIR空白對照組出生后12,13,14,15,16,17,21,30天小鼠,異硫氰酸標(biāo)記的右旋糖酐(FD-2000S)行上腔靜脈灌注,視網(wǎng)膜鋪片,熒光顯微鏡對比觀察氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜新生血管形態(tài)學(xué)變化,應(yīng)用Real-time PCR檢測對比兩組間相應(yīng)日齡小鼠視網(wǎng)膜ANXA2 mRNA的表達變化。選擇小鼠出生后17天(P17)時間點,分別提取4組中小鼠視網(wǎng)膜標(biāo)本,通過視網(wǎng)膜鋪片方法對比觀察視網(wǎng)膜新生血管形態(tài)學(xué)變化,Real-time PCR及Western blot檢測各組中ANXA2的表達及ANXA2基因干擾后新生血管相關(guān)因子Vegfa,Mmp2,Mmp9, Timp2的表達變化。應(yīng)用SPSS軟件對數(shù)據(jù)行統(tǒng)計學(xué)處理,應(yīng)用單因素方差分析進行組間比較(P0.05)。 結(jié)果 (1)體外實驗：高糖對照組HUVEC中ANXA2表達顯著高于正常組(P0.05)。高糖對照組HUVEC的增殖,細胞遷移數(shù)量(102.3±4.9 VS 50.3±2.5)和成管數(shù)量(17.3±1.5 VS 10±1.4)以及VEGFA, MMP2,MMP9和TIMP2的mRNA表達均顯著高于正常組(P0.05)�；蚋蓴_后,在基因和蛋白水平均表明ANXA2在陰性干擾組表達無明顯改變,在陽性干擾組表達有明顯下降,SiANXA2可以成功干擾ANXA2基因的表達。ANXA2基因表達下降后,HUVEC的增殖、細胞遷移數(shù)量(41.1±1.5 VS 102.3±4.9)和成管數(shù)量(7.6±1.2 VS 17.3±1.5)顯著下降,VEGFA,MMP2,MMP9,TIMP2表達明顯下調(diào)(P0.05)。 (2)體內(nèi)實驗：ANXA2在視網(wǎng)膜血管發(fā)育旺盛期高表達,在平緩期低表達。P17小鼠視網(wǎng)膜鋪片發(fā)現(xiàn),與OIR空白對照組和OIR陰性干擾組相比,OIR陽性干擾組視網(wǎng)膜新生血管迂曲現(xiàn)象減輕,血管滲漏較少,微血管瘤及新生血管芽減少。視網(wǎng)膜層次較明顯。OIR空白對照組ANXA2表達顯著高于正常組(P0.05)。ANXA2基因沉默后,ANXA2在OIR陽性干擾組表達有明顯下降(P0.05)。Vegfa,Mmp2,Mmp9在OIR空白對照組較正常組顯著上調(diào),在OIR陽性干擾組較OIR空白對照組顯著下調(diào)(P0.05)。 結(jié)論ANXA2在高糖培養(yǎng)的HUVEC和氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜新生血管中均高表達,與血管內(nèi)皮細胞內(nèi)皮細胞增殖,遷移和成管能力相關(guān),可調(diào)節(jié)新生血管相關(guān)因子的表達,參與視網(wǎng)膜新生血管的形成。RNA干擾技術(shù)能成功抑制ANXA2基因的表達,ANXA2有望成為防治視網(wǎng)膜新生血管新的靶點。
[Abstract]:Objective To observe the effect of ANXA2 on high glucose in vitro cultured human umbilical vein endothelial cells (Human umbilical vein endothelial cells, HUVEC) C57BL/6J expression of retinal neovascularization in mice induced by ANXA2 and oxygen, on the migration of HUVEC proliferation, tube formation effect ability, influence on the development of retinal neovascularization in mice, and the regulation of the expression of related factors on the neovascularization, formation of ANXA2 effect and mechanism in the process of retinal neovascularization.
Method
(1) the application of HUVEC cells in vitro were divided into four groups: normal group (Normal, cultured under high glucose), high glucose group (Mock treatment), the negative interference group (SiControl), the positive interference group (SiANXA2). Annexin A2 detected by Real-time PCR and Western blot method the experimental group HUVEC (ANXA2) gene and protein expression of MTT was detected in 0h, 24h, 48h and 72h cell proliferation, observed in each experimental group cell migration scratch test, experimental evaluation of cell into a tube into the tube. And through the Real-time PCR detection of neovascularization in each experimental group related factor VEGFA MMP2, MMP9, mRNA, TIMP2 expression.
(2) in vivo experiments using C57BL/6J mice. Mice 7 days after birth, 75-80% into the oxygen concentration of oxygen inside take out after 5 days under normal circumstances were constructed with oxygen induced (OIR) mouse model. The experiment was divided into four groups: normal group (Normal, normal feeding), OIR control group (Mock, no treatment), OIR the negative interference group (SiANXA2_M), and OIR positive interference group (SiANXA2) respectively. Normal group and OIR control group 12,13,14,15,16,17,21,30 days after birth in mice, fluorescein isothiocyanate dextran (FD-2000S) for superior vena cava perfusion, retinal flatmount, fluorescence microscopy observation changes of retinal neovascularization in oxygen induced morphological changes in the expression of. Comparison and application of Real-time PCR in two groups were detected between the corresponding day old mouse retinal ANXA2 mRNA. Mice 17 days after birth (P17) time points were extracted from the 4 groups in the mouse retina retinal flatmount specimens, through comparative observation method Changes of retinal neovascularization morphology, ANXA2 gene and expression of ANXA2 Real-time PCR and Western blot interference were detected in the angiogenesis related factors Vegfa, Mmp2, Mmp9, Timp2 expression changes. Application of SPSS software for data processing, using single factor analysis of variance were compared between the groups (P0.05).
Result
(1) in vitro: high glucose control group HUVEC ANXA2 expression was significantly higher than the normal group (P0.05). The proliferation of high glucose control group HUVEC, the number of cell migration (102.3 + 4.9 VS 50.3 + 2.5) and the number of tubes (17.3 + 1.5 VS 10 + 1.4), VEGFA, MMP2, MMP9 and TIMP2 mRNA DA were significantly higher than the normal group (P0.05). After gene interference, in gene and protein levels showed that ANXA2 in the negative interference group showed no significant change in the positive interference group was significantly decreased, SiANXA2 can be successfully interfered with the expression of.ANXA2 gene ANXA2 gene expression decreased after HUVEC cells proliferation, migration (41.1. 1.5 VS 102.3 + 4.9) and the number of tubes (7.6 + 1.2 VS 17.3 + 1.5) decreased significantly, VEGFA, MMP2, MMP9, TIMP2 gene expression was significantly decreased (P0.05).
(2) in vivo: high expression of ANXA2 in retinal vascular development in the period of vigorous period of low expression of.P17 mice retinas, OIR and blank control group and OIR group compared with the negative interference, reduce OIR positive interference group, retinal neovascularization is tortuous vascular leakage phenomenon, fewer microaneurysms and new vascular buds decreased the retina is obvious..OIR control group the expression of ANXA2 was significantly higher than the normal group (P0.05) after.ANXA2 gene silencing, ANXA2 expression was significantly decreased in OIR positive interference group (P0.05).Vegfa, Mmp2, Mmp9 group compared with normal group were significantly up-regulated in OIR gap in OIR positive interference group compared with the OIR control group was significantly reduced (P0.05).
Conclusion ANXA2 induced retinal neovascularization in mice were highly expressed in HUVEC cultured with high glucose and oxygen, and endothelial cell proliferation, migration and tube formation ability, can adjust the expression of angiogenesis related factors, the formation of.RNA interference can successfully inhibit the expression of ANXA2 gene in retinal neovascularization, ANXA2 is expected to become the target the prevention and treatment of retinal neovascularization.

【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R774.1

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本文編號：1706581