本文選題：腫瘤基因治療　切入點(diǎn)：聚乙烯亞胺　出處：《吉林大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：惡性腫瘤是當(dāng)今社會(huì)影響人類健康的主要疾病。近年來(lái)，隨著人們對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展等相關(guān)分子機(jī)制的深入研究，腫瘤的基因治療受到了越來(lái)越多的關(guān)注。腫瘤基因治療的核心問(wèn)題是如何將治療基因安全高效的運(yùn)輸?shù)桨衅鞴俸桶屑?xì)胞。因此，基因傳遞載體的選擇至關(guān)重要。 目前廣泛應(yīng)用于腫瘤基因治療的遞送體系有病毒載體和非病毒載體兩類。其中，病毒類載體具有較高的轉(zhuǎn)染效率，但存在一定的安全隱患，如病毒基因致病或誘發(fā)人體過(guò)激免疫反應(yīng)等；另外病毒載體自身很少具有對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別能力，有將治療性基因大量帶入正常細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)。相對(duì)于病毒載體，非病毒載體的轉(zhuǎn)染效率偏低，但由于其具有較好的安全性和易修飾性等特點(diǎn)，被寄予厚望。陽(yáng)離子多聚物載體作為結(jié)構(gòu)靈活，易于合成和改性，可引入特異靶向基團(tuán)修飾的非病毒載體備受關(guān)注。其中，聚乙烯亞胺（PEI）是一種常用的體外陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染試劑，能夠通過(guò)“質(zhì)子海綿”效應(yīng)促進(jìn)DNA溶酶體逃逸，其特點(diǎn)是轉(zhuǎn)染效率高，但細(xì)胞毒性較大。殼聚糖（CS）是一種天然陽(yáng)離子多糖，具有毒性低、生物相容性好、生物可降解、表面活性基團(tuán)多等特點(diǎn)，但由其介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染效率相對(duì)較低。 本文根據(jù)PEI和殼聚糖的各自特點(diǎn)，在殼聚糖基因傳遞體系中引入PEI分子，利用超分子組裝的方法制備CS復(fù)合納米基因傳遞載體，以提高CS載體的轉(zhuǎn)染效率，對(duì)其制備處方進(jìn)行優(yōu)化，并在體系中引入可以靶向識(shí)別鼻咽癌細(xì)胞的小肽，，通過(guò)物理化學(xué)和細(xì)胞學(xué)手段評(píng)價(jià)新型載體的基本性能、基因轉(zhuǎn)染效率、安全性。在上述基礎(chǔ)上，本文還引入基因表達(dá)限制性調(diào)控元件，考察了載體攜載該基因在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)特異性。具體內(nèi)容主要包括以下幾個(gè)方面： 1．殼聚糖復(fù)合納米基因載體的制備及處方優(yōu)化。通過(guò)對(duì)N/P比為1～10的PEI/DNA復(fù)合物進(jìn)行表征，確定當(dāng)N/P在6～10范圍內(nèi)，PEI/DNA復(fù)合物形態(tài)規(guī)則，粒徑均勻；選取濃度為0.05%、0.1%、0.2%(w/v)殼聚糖溶液包裹PEI/DNA復(fù)合物，通過(guò)比較在CNE細(xì)胞中的luciferease表達(dá)量、MTT值來(lái)考察殼聚糖的濃度及PEI/DNA的N/P比對(duì)復(fù)合載體轉(zhuǎn)染效率及安全性的影響，發(fā)現(xiàn)隨著PEI量的增加，轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞毒性都呈增加趨勢(shì)，殼聚糖的加入可有效降低PEI的細(xì)胞毒性，最終獲得了PEI、CS及DNA三者的最佳配比，即PEI/DNA的N/P=8，殼聚糖濃度為0.1%(w/v)。 2．靶向肽修飾殼聚糖復(fù)合納米基因載體的制備及靶向性質(zhì)考察。通過(guò)熒光顯微鏡技術(shù)觀察發(fā)現(xiàn)靶向頭頸癌細(xì)胞的12肽（TSPNHINGQKL）能夠靶向識(shí)別鼻咽癌細(xì)胞（HNE-1、CNE）；通過(guò)化學(xué)方法，將靶向肽與殼聚糖共價(jià)偶聯(lián)，制備靶向修飾的殼聚糖復(fù)合納米基因載體；通過(guò)DNA保護(hù)、體外穩(wěn)定性考察及細(xì)胞轉(zhuǎn)染等試驗(yàn)證實(shí)該靶向復(fù)合納米載體安全、穩(wěn)定且轉(zhuǎn)染活性不受體內(nèi)環(huán)境（血清、酶）的影響，在HNE-1、CNE細(xì)胞中介導(dǎo)的表達(dá)顯著提高，而在對(duì)照細(xì)胞（乳腺癌細(xì)胞ZR-75-30和人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5）中則無(wú)顯著差別，可實(shí)現(xiàn)“載體轉(zhuǎn)移靶向性”功能。 3．載體轉(zhuǎn)移靶向和基因轉(zhuǎn)錄靶向雙開(kāi)關(guān)體系的構(gòu)建。利用分子克隆等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，在設(shè)計(jì)的表達(dá)基因中，引入基因表達(dá)限制性調(diào)控元件腫瘤特異survivin啟動(dòng)子，利用靶向殼聚糖復(fù)合納米載體攜載該基因構(gòu)建載體轉(zhuǎn)移靶向和基因轉(zhuǎn)錄靶向雙開(kāi)關(guān)體系，對(duì)該體系在HNE-1、CNE、ZR-75-30、MRC-5細(xì)胞中的表達(dá)情況進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該體系只能在癌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，在正常細(xì)胞中則無(wú)表達(dá)或低表達(dá)，并能選擇性的在鼻咽癌細(xì)胞中高效表達(dá)；在表達(dá)基因中引入HSV-TK/GCV自殺基因系統(tǒng)，通過(guò)MTT法初步驗(yàn)證了靶向復(fù)合載體能夠通過(guò)載體轉(zhuǎn)移靶向及基因轉(zhuǎn)錄靶向兩種方式，攜載治療基因進(jìn)入鼻咽癌細(xì)胞并對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生特異的殺傷和抑制作用。 本文研究制備的鼻咽癌靶向殼聚糖復(fù)合納米基因載體是一種高效、安全的非病毒載體，具備載體轉(zhuǎn)移靶向和基因轉(zhuǎn)錄靶向雙重靶向的功能，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。
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【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R739.63

【參考文獻(xiàn)】

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1 盧韻;姚靜;周建平;王偉;鄧祖媛;關(guān)麗葉;;聚乙烯亞胺-DNA復(fù)合物的形成和聚集行為研究[J];藥學(xué)學(xué)報(bào);2009年06期

2 陳瑞杰;腫瘤基因治療進(jìn)展[J];醫(yī)藥導(dǎo)報(bào);2004年07期

本文編號(hào)：1704937