本文選題：長鏈非編碼RNA　切入點：HNF1A-AS　出處：《吉林大學》2016年博士論文

【摘要】：目的:鼻咽癌是我國一種常見的頭頸部腫瘤之一,起病隱匿,大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)較晚,預后不好。對鼻咽癌的治療以放療為主,盡管在治療手段上有一定的進展,但是對于患者5年生存率來說,并沒有顯著提高。至今,鼻咽癌的發(fā)病機制仍然不夠明確。長鏈非編碼RNA對于生命活動具有重要的調(diào)節(jié)功能,我們主要研究長鏈非編碼RNA HNF1A-AS與鼻咽癌之間存在什么樣的關系。研究HNF1A-AS在鼻咽癌中的表達變化,證明HNF1A-AS具有促進鼻咽癌細胞增殖、遷移和侵襲的作用,并進一步研究鼻咽癌細胞獲得遷移和侵襲能力與HNF1A-AS的關聯(lián)。方法:首先,取20例鼻咽癌患者的腫瘤組織作為實驗組,取其鄰近的正常組織作為對照組,我們通過定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(q RT-PCR)來檢測實驗組和對照組中HNF1A-AS的含量。在人體組織中得出結(jié)果后進而在細胞水平進一步研究。培養(yǎng)鼻咽癌細胞系5-8F,6-10B,HONE-1,CNE-2,SUNE-1和C666-2作為實驗組,人鼻咽上皮細胞NP69作為非癌性細胞對照組,進行q RT-PCR實驗,在細胞水平證明HNF1A-AS在癌細胞和對照組中的表達變化。選取變化最大的兩種細胞系CNE-2,SUNE-1進行后續(xù)實驗。設計靶向干擾HNF1A-AS序列的si RNA作為實驗組,選取RNA干擾實驗常用的陰性對照序列作為對照組(scrambled si RNA)。我們將攜帶了HNF1A-AS-si RNA(以及scrambled si RNA)的慢病毒載體進行包裝、純化,并進行了病毒滴度測定。將攜帶了HNF1A-AS-si RNA(以及scrambled si RNA)的慢病毒載體轉(zhuǎn)染到CNE-2,SUNE-1細胞中。進行q RT-PCR實驗來檢測轉(zhuǎn)染成功后的細胞株中HNF1A-AS的表達變化。再繼續(xù)將對實驗組和對照組進行HNF1A-AS功能研究的實驗。通過細胞增殖能力(MTT)、克隆形成能力實驗、細胞劃痕實驗、Transwell細胞遷移實驗、Transwell細胞侵襲實驗來研究HNF1A-AS對細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響,再通過細胞周期實驗來進一步研究HNF1A-AS在細胞增殖中的作用。將實驗組和對照組的鼻咽癌細胞株接種到24只雄性小鼠,每周測量一次腫瘤體積,來研究HNF1A-AS對體外成瘤能力的影響。最后,通過免疫印跡分析來研究HNF1A-AS介導細胞遷移的可能作用機制。結(jié)果:腫瘤組織中的HNF1A-AS m RNA水平明顯高于鄰近非癌性組織,與對照組相比,鼻咽癌組織中HNF1A-AS平均水平高于非癌性組織3倍以上,P0.001。HNF1A-AS在鼻咽癌細胞系中均表達上調(diào),在SUNE-1,CNE-2細胞中含量最高,HNF1A-AS在SUNE-1細胞中的水平增加了8倍,而在CNE-2細胞中表達更高,增加了9.2倍,p0.05(5-8F,HONE-1);P0.01(6-10B,CNE-2,SUNE-1,C666-1)。用攜帶并能穩(wěn)定表達scrambled和特異性HNF1A-AS si RNA的慢病毒載體轉(zhuǎn)染至CNE-2,SUNE-1細胞。熒光顯微鏡提示轉(zhuǎn)染效率70%。q RT-PCR結(jié)果顯示CNE-2,SUNE-1細胞中HNF1A-AS m RNA水平顯著下降。在CNE-2細胞中,與對照組相比,HNF1A-AS-si RNA組的HNF1A-AS水平降低了76%,在SUNE-1細胞中HNF1A-AS的水平降低到14%,p0.01(CNE-2),p0.001(SUNE-1)。細胞增殖和克隆形成能力:MTT結(jié)果顯示,第四天時CNE-2細胞的增殖速率降低了32.5%,而SUNE-1細胞在第三天時增殖速率降低了33.3%。HNF1A-AS干擾后增殖速率減慢�？寺⌒纬蓪嶒烇@示HNF1A-AS-si RNA組能抑制CNE-2,SUNE-1細胞系克隆形成。量化結(jié)果顯示,在CNE-2細胞中,在scrambled si RNA(對照組)處理組中,約形成了70個集落,而在特異性si RNA處理組的中僅觀察到21個集落;同樣,在SUNE-1細胞中,在scrambled si RNA處理組中,約形成了60個集落,而在特異性si RNA處理組的中僅觀察到19個集落,p0.01(CEN-2,SUNE-1)。細胞劃痕和細胞遷移侵襲能力實驗:HNF1A-AS被干擾后,CNE-2,SUNE-1細胞的遷移能力受到抑制。在CNE-2細胞中,scrambled組長滿了劃痕面積的67%,而HNF1A-AS-si RNA組僅長了44%;在SUNE-1細胞中,scrambled對照組長滿了劃痕面積的51%,而HNF1A-AS-si RNA組僅長了25%,p0.01(CEN-2,SUNE-1)。transwell定量實驗顯示,CNE-2細胞遷移到下室的數(shù)量降低了66.7%,SUNE-1細胞遷移到下室的數(shù)量降低了62.5%。侵襲實驗結(jié)果顯示,CEN-2,SUNE-1兩種細胞的遷移數(shù)量與對照組相比分別降低了69.6%,62.5%,p0.01(CEN-2,SUNE-1)。細胞周期實驗:在CNE-2細胞中,HNF1A-AS干擾使G0/G1期細胞數(shù)量增加了1.5倍左右,但卻使S期和G2/M期的細胞數(shù)量分別降低了65%和66.7%。同樣,HNF1A-AS-si RNA處理組的SUNE-1細胞中超過25.7%的S期和G2/M期細胞轉(zhuǎn)移至G0/G1期,p0.01(CEN-2,SUNE-1)。鼻咽癌模型小鼠實驗:我們每周對小鼠腫瘤體積進行測量,發(fā)現(xiàn)從第三周起HNF1A-AS-si RNA和對照組的腫瘤體積存在很大的差別,注射CNE-2細胞的小鼠腫瘤體積在第三周和第四周分別降低了58.8%和64%;相似的結(jié)果在注射SUNE-1細胞的小鼠中也有體現(xiàn),與對照組相比,HNF1A-AS-si RNA的腫瘤體積在第三周和第四周分別降低了54%和69.7%,p0.05(CEN-2,SUNE-1)。免疫印跡分析:CNE-2,SUNE-1細胞中,HNF1A-AS干擾使上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的標志性信號因子Cd C25C,cyclin B1,Snail,N-cadherin,vimentin表達明顯受到抑制,E-cadherin表達增加。結(jié)論:HNF1A-AS在鼻咽癌組織及細胞系中均過表達。HNF1A-AS干擾可抑制細胞增殖和克隆形成還能抑制細胞遷移與侵襲。HNF1A-AS干擾可引起鼻咽癌細胞周期停滯在G0/G1期。HNF1A-AS干擾抑制鼻咽癌模型鼠的腫瘤生長。HNF1A-AS敲干擾可逆轉(zhuǎn)EMT過程。綜上所述,長鏈非編碼RNA HNF1A-AS與鼻咽癌細胞增殖,遷移和侵襲密切相關,其引起細胞遷移和侵襲的作用的機制可能是參與到了EMT過程有關。這就提示我們通過對長鏈非編碼RNA HNF1A-AS進一步的研究來為鼻咽癌的診斷和治療提供新的方向。
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【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R739.63

【參考文獻】

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本文編號：1695333