本文選題：Ⅱ型前庭毛細胞　切入點：乙酰膽堿　出處：《華中科技大學》2012年博士論文

【摘要】：第一部分 豚鼠Ⅱ型前庭毛細胞存在功能性m2膽堿能受體 目的研究豚鼠Ⅱ型前庭毛細胞上BK電流的膽堿能受體特性。 方法應用全細胞膜片鉗技術(shù)檢測單離豚鼠前庭Ⅱ型毛細胞ACh激活的BK電流對不同膽堿能受體及其亞型的激動劑和拮抗劑的反應特性。 結(jié)果①細胞外應用BK通道阻滯劑iberiotoxin (IBTX)200nM可強力阻斷ACh激活的外向電流；②細胞外應用傳統(tǒng)的N型膽堿能受體拮抗劑美加明(mecamylamine, MLA)和alpha9-N型膽堿能受體拮抗劑士的寧(strychnine)對此電流沒有阻斷作用；③細胞外應用ml-4亞型M受體拮抗劑,發(fā)現(xiàn)此電流對m2型選擇性膽堿能受體拮抗劑methoctramine敏感,而對m1型選擇性膽堿能受體拮抗劑pirenzepine、m3型選擇性膽堿能受體拮抗劑4-DAMP和m4型選擇性膽堿能受體拮抗劑tropicamide不敏感；④在同一Ⅱ型毛細胞上,傳統(tǒng)的M型膽堿能受體激動劑Carbamyl-β-methylcholine chloride (CCh)和m2型膽堿能受體特異性激動劑Arecaidine propargyl ester (APE)均能激活Ⅱ型前庭毛細胞ACh-敏感性BK電流,且對m2型選擇性膽堿能受體拮抗劑methoctramine敏感,可以被methoctramine強力阻斷。 結(jié)論Ⅱ型前庭毛細胞BK型膽堿能傳出抑制由m2型膽堿能受體介導。 第二部分豚鼠Ⅱ型前庭毛細胞m2mAChR介導的膽堿能抑制的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導機制 目的研究豚鼠Ⅱ前庭毛細胞m2AChR介導BK型膽堿能抑制的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導機制。 方法應用全細胞膜片鉗技術(shù),檢測Ⅱ前庭毛細胞ACh敏感性BK電流對細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導相關(guān)試劑的反應特性。 結(jié)果①Ⅱ型前庭毛細胞內(nèi)透析G蛋白激動劑GTPyS,可以激活ACh-敏感性BK電流,細胞外應用Gi蛋白α亞單位抑制劑GAPnt-2對ACh-敏感性BK電流沒有阻斷作用,細胞內(nèi)透析pertussis toxin (PTX)可以明顯阻斷Ⅱ前庭毛細胞ACh敏感性BK電流,此結(jié)果提示Gi蛋白βγ亞單位二聚體在此信號轉(zhuǎn)導中起主要作用；②細胞外應用cAMP膜可滲透性類似物db-cAMP可激活與ACh敏感性BK電流類似的電流,同時ACh敏感性BK電流亦能夠被AC特異性阻斷劑2,5-dd-Ado明顯阻斷,提示AC/cAMP參與了該電流的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導。 結(jié)論M2型膽堿能受體與細胞內(nèi)Gi蛋白偶聯(lián),通過激活Gi蛋白βγ亞單位二聚體-AC/cAMP-PKA通路介導的鈣離子通道蛋白質(zhì)磷酸化使Ca2-內(nèi)流,引起B(yǎng)K通道開放,細胞內(nèi)K+外流,從而導致Ⅱ型前庭毛細胞超級化。
[Abstract]:Part one
The existence of functional M2 cholinergic receptor in guinea pig type II vestibular hair cells
Objective to study the characteristics of the cholinergic receptor on the BK current on the vestibular hair cells of guinea pig type II.
Methods whole cell patch clamp technique was used to detect the ACh activated BK currents in the vestibular type II hair cells of guinea pigs, and their response characteristics to agonists and antagonists of different cholinergic receptors and their subtypes.
The extracellular application of BK channel blocker iberiotoxin (IBTX) 200nM can be effectively blocked the outward current activated by ACh; the extracellular application of N choline can traditional receptor antagonist mecamylamine (mecamylamine, MLA) and type alpha9-N cholinergic receptor antagonist strychnine (strychnine) have no current blocking effect; ML-4 type M receptor antagonist application cell, found that the current sensitive receptor antagonist methoctramine on type M2 cholinergic receptor antagonist, and pirenzepine on M1 selective choline, m3 cholinergic receptor antagonist 4-DAMP and M4 cholinergic receptor antagonist tropicamide is not sensitive to the same; type II hair cells, type M cholinergic receptor agonist Carbamyl- to traditional beta -methylcholine chloride (CCh) and type M2 cholinergic receptor specific agonist of Arecaidine propargyl ester (APE) All of them can activate ACh- sensitive BK currents in type II vestibular hair cells, and are sensitive to M2 type selective cholinergic receptor antagonist methoctramine, and can be blocked by methoctramine.
Conclusion the BK cholinergic efferent inhibition of type II vestibular hair cells is mediated by the M2 cholinergic receptor.
The intracellular signal transduction mechanism of m2mAChR mediated cholinergic inhibition in the second part of guinea pig type II vestibular hair cells
Objective to investigate the intracellular signal transduction mechanism of m2AChR cholinergic inhibition mediated by the vestibular hair cells (vestibule) of guinea pig II.
Methods the whole cell patch clamp technique was used to detect the response characteristics of the ACh sensitive BK current of the vestibular hairy cells to the intracellular signal transduction related reagents.
The results of dialysis G protein in type II vestibular hair cells in the agonist GTPyS, can activate ACh- sensitive BK current, extracellular application of Gi protein alpha subunit inhibitor GAPnt-2 had no blocking effect on ACh- sensitive BK current, intracellular dialysis pertussis toxin (PTX) can obviously block II vestibular hair cells of ACh sensitive BK current, the results suggest that Gi protein beta gamma subunit two poly plays a major role in signal transduction in the body; the extracellular application of cAMP membrane permeable analogue db-cAMP can activate the current similar to ACh sensitive BK current at the same time, the sensitivity of ACh BK current can also be AC specific inhibitor 2,5-dd-Ado inhibited, suggesting that AC/cAMP involved in the current intracellular signal transduction.
Conclusion type M2 cholinergic Gi protein coupled receptors and intracellular calcium ion channel protein phosphorylation through activation of Gi protein beta gamma subunit two dimer -AC/cAMP-PKA pathway mediated the influx of Ca2-, caused by the opening of BK channels in cell K+ outflow, resulting in type II vestibular hair cells of super.

【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R764

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本文編號：1682480