本文選題：Tat　切入點：PTD　出處：《山東大學》2012年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：糖尿病視網膜病變、年齡相關性黃斑變性等疾病會引起眼底部位的血管增生,使視功能受到嚴重損害,甚至失明。目前,臨床上大都采用眼內注射或激光光凝法治療眼底血管增生,而這些方式往往會造成視網膜嚴重不可逆損傷。因此,尋找能夠防治眼內血管生成且副作用小的藥物具有重大的社會和經濟意義。內皮抑素(endostatin, Es)是一種內源性血管內皮細胞增殖的強效抑制劑,我國已將重組人血管內皮抑素研制成具有自主知識產權的國家一類新藥(Endostar,即恩度、YH16)用以治療非小細胞肺癌。與傳統(tǒng)化療藥物相比,Es具有毒副作用小、不易產生耐藥性等優(yōu)點。Es不僅在治療腫瘤方面有其獨特的優(yōu)勢,在防治眼部新生血管性疾病方面也取得一些可喜的成就。研究證明,通過球結膜下注射、玻璃體腔注射,Es及Es基因均可抑制眼部新生血管的形成。但是,由于Es是生物大分子,不能透過眼球屏障,必須通過眼內注射方式才能發(fā)揮療效,而這種操作方式難度大,容易損傷眼球內組織,甚至會對病人造成不可逆的損傷,所以尋找簡便、安全、有效的給藥途徑具有重要的臨床意義。能夠穿透細胞膜的HIV-1反式轉錄因子的蛋白轉導域(protein transduction domain of the transacting activator of transcription, Tat PTD)能夠攜帶穿透能力差的藥物進入細胞,且具有攜帶藥物透穿透眼球屏障的可能性。故本課題擬利用穿膜肽Tat PTD的穿膜作用和內皮抑素的抑制新生血管生成的作用,將二者通過基因工程的手段融合在一起,以期獲得能夠穿透眼球屏障的內皮抑素,達到通過簡單的局部滴眼給藥預防視網膜或脈絡膜血管增生的目標。本課題的研究內容及取得的主要成果有以下幾個方面。 1Tat PTD-endostatin (Tat PTD-Es)在畢赤酵母中的表達及純化 本課題構建了Tat PTD-Es融合基因及酵母分泌型表達載體pGAPZαA/Tat PTD-Es(pG/TE)及pGAPZaA/Es(pG/E)。采用電轉化法將重組質粒轉入畢赤酵母菌(GS115),篩選陽性菌落,SDS-PAGE檢測目的蛋白。利用鎳離子親和層析對表達產物進行初步純化。結果表明Tat PTD-Es的畢赤酵母表達體系構建成功,但表達量低。 2Tat PTD-Es在大腸桿菌中的表達、復性及純化 采用大腸桿菌表達系統(tǒng)對Tat PTD-Es及Es進行了融合表達。選用pET28a作為表達載體,構建重組質粒pET28a/Tat PTD-Es (pET28a/TE)和pET28a/Es (pET28a/E),轉入E.coli Rosetta(DE3)中誘導表達目的蛋白。選用溫度37℃,誘導時間4h的條件對工程菌株進行誘導,SDS-PAGE檢測目的蛋白。摸索了包涵體的洗滌條件,采用直接稀釋法對包涵體蛋白Tat PTD-Es及Es進行復性,采用Hi strap預裝柱對復性后的蛋白進行了純化,得到了高純度的目的蛋白,SDS-PAGE結果顯示Tat PTD-Es的分子量為22kD, Western blot結果顯示目的蛋白可以與6xHis抗體結合,表明目的蛋白含有6xHis標簽。 3Tat PTD-Es的體內外活性及入胞機制研究 采用CCK-8法測定了Tat PTD-Es及Es對人臍靜脈內皮細胞EAHY926增殖的抑制作用,結果表明：Tat PTD-Es及Es均能顯著地抑制內皮細胞的增殖,且抑制率呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性,即隨著濃度的增加對細胞生長的抑制率也增加;Tat PTD-Es在低濃度時(0.2μmol/L,0.8μmol/L)活性要高于Es,當濃度大于4μmol/L時,Tat PTD-Es及Es抑制率均大于80%。 建立雞胚絨毛尿囊膜(CAM)模型,評價復性純化后的Tat PTD-Es及Es對CAM血管生成的影響,以生理鹽水作為空白對照,堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)作為陰性對照,觀察了Tat PTD-Es及Es對bFGF誘導的CAM血管生成的抑制作用。與bFGF組(12.18±4.72)比較,Tat PTD-Es及Es組的CAM血管數(shù)分別減少至(30.74±6.47)及(14.56±6.21)(p0.05),結果表明,Tat PTD-Es及Es均能夠明顯抑制bFGF誘導的CAM血管的生成。 采用熒光顯微鏡和流式細胞術對Tat PTD-Es與Es的入胞能力進行了比較。結果表明FITC標記的Tat PTD-Es與Es與人臍靜脈內皮細胞EAHY926共孵育4h后,Es組的熒光信號很弱,細胞陽性率僅為33.61%；而Tat PTD-Es組的熒光信號與Es相比有很明顯的增強,細胞陽性率高達99.28%,提示Tat PTD與Es融合表達后有利于蛋白質穿透細胞膜進入細胞,而使進入細胞的蛋白質大大增加,可能有利于其在胞內更好地發(fā)揮作用。考察了蛋白Tat PTD-Es濃度、孵育時間對人臍靜脈內皮細胞EAHY926攝取蛋白質的影響及各種胞吞途徑抑制劑對Tat PTD-Es進入人臍靜脈內皮細胞EAHY926的影響。結果表明,蛋白質濃度在1μmol/L～10μmol/L范圍內,EAHY926細胞對Tat PTD-Es的攝取有劑量依賴性,相對熒光強度從20.72AU增加到305.23AU。隨著Tat PTD-Es與細胞孵育時間的延長,EAHY926對Tat PTD-Es的攝取也逐漸增加。5min-2h內熒光強度增加較為迅速,熒光強度從17.16增加到221.37,之后增加較為平緩,4h時的熒光強度增加至249.18。 考察了各種胞吞途徑抑制劑對Tat PTD-Es進入人臍靜脈內皮細胞EAHY926的影響。細胞經4℃和NaN3(ATP抑制劑)處理后,與對照組相比,熒光信號大大減弱,熒光強度分別降低了92.49%、94.91%,說明溫度、ATP在EAHY926細胞攝取Tat PTD-Es的過程中起到非常重要的作用,其入胞過程是溫度、能量依賴的。而經蔗糖(網格蛋白clathrin途徑抑制劑)、氯丙嗪(clathrin途徑抑制劑)、木黃酮(小窩途徑caveolae抑制劑)、細胞松弛素D(巨胞飲途徑抑制劑)等不同攝取途徑抑制劑處理后的EAHY926細胞對蛋白質的攝取均有所減弱,但是減弱的程度不盡相同。蔗糖及氯丙嗪處理后,熒光強度分別為原來的36.71%及36.86%,均減少了60%左右,提示clathrin途徑也可能是Tat PTD-Es入胞機制之一。木黃酮處理后的細胞,熒光強度為原來的66.57%,降低了33%,表明Tat PTD-Es的入胞可能也與caveolae有關。細胞松弛素D處理后的細胞,熒光強度為原來的27.52%,降低了72%,提示巨胞飲也是Tat PTD-Es入胞的潛在途徑。由這些結果我們推測,Tat PTD-Es入胞可能不只遵循一種途徑,而是幾種途徑同時存在。 4Tat PTD-Es穿透眼球屏障的能力與體內藥效學研究 小鼠分組后,分別玻璃體注射和滴眼Tat PTD-Es與Es組,生理鹽水滴眼組作為空白對照。取小鼠眼球,切片,用小鼠6×His抗體作為一抗做免疫組化,檢測視網膜層是否有目的蛋白。結果顯示,玻璃體注射Tat PTD-Es與Es后,視網膜細胞層均有目的蛋白,表明經玻璃體注射后藥物能夠較快到達視網膜。滴眼給藥時,Es組小鼠視網膜細胞層沒有目的蛋白的分布,表明通過滴眼給藥Es不能到達視網膜,而Tat PTD-Es組小鼠視網膜細胞層出現(xiàn)了目的蛋白,證明通過滴眼給藥Tat PTD能夠攜帶Es穿透眼球屏障到達視網膜,達到了我們的預期目的。 通過激光燒傷法建立小鼠脈絡膜新生血管(CNV)模型,滴眼或玻璃體注射Tat PTD-Es及Es,生理鹽水滴眼組作為陰性對照,玻璃體注射Avastin作為陽性對照。實驗結果表明,玻璃體注射Tat PTD-Es、Es組的小鼠眼部的CNV血管生成面積分別為(961.2±86.9)μm2和(944.6±88.3)μm2,與陰性藥物組(2623.6±240.9)μm2相比CNV面積明顯減少(p0.01),且與陽性藥物Avastin組(863.5±50.1)μm2相比沒有顯著性差異。Es滴眼給藥時,CNV面積為(2514.7±260.7)μm2,與生理鹽水組相比沒有顯著性差異,表明Es滴眼后Es不能到達眼底,不能抑制CNV的生成。而Tat PTD-Es滴眼給藥組的CNV面積(1378.4±154.3)μm2,與陰性藥物組相比CNV面積明顯減少(p0.01)。滴眼給藥Tat PTD-Es能夠抑制CNV血管的生成,此結果進一步證明了通過局部滴眼給藥后Tat PTD-Es能夠穿透眼球屏障到達視網膜脈絡膜發(fā)揮其作用。 本研究取得的成果和結論： (1)首次構建了Tat PTD-Es的畢赤酵母工程表達菌株。 (2)首次構建了表達Tat PTD-Es的大腸桿菌表達系統(tǒng),對蛋白質成功進行了表達,并對其包涵體進行了復性、純化,得到了高純度的目的蛋白。 (3)復性純化的Tat PTD-Es及Es能夠明顯抑制EAHY926細胞的增殖、CAM血管生成,表明其具有較好的體外活性。 (4) Tat PTD-Es比Es具有更好的入胞能力,且其進入EAHY926細胞時遵循多種入胞機制。 (5) Tat PTD-Es局部滴眼給藥后能夠穿透眼球屏障到達眼底視網膜脈絡膜組織,且在體內表現(xiàn)出了較好的抑制脈絡膜血管生成的活性。
[Abstract]:Diabetic retinopathy, age-related macular degeneration and other diseases can cause retinal vascular hyperplasia, the visual function damage, and even blindness. At present, most of the clinical intraocular injection or laser photocoagulation treatment of retinal vascular proliferation, which often cause serious retinal irreversible damage. Therefore, looking to have great social and economic significance for prevention and treatment of ocular angiogenesis and the side effects of drugs. Endostatin (endostatin, Es) is a potent inhibitor of endogenous vascular endothelial cell proliferation, China has developed into a recombinant human endostatin in countries with independent intellectual property rights of a class of drugs (i.e. Endostar, Endostar, YH16) for the treatment of non-small cell lung cancer. Compared with the traditional chemotherapy drugs, Es has little side effect, not easy to produce drug resistance and other advantages of.Es not only in the treatment of tumor has its own 鐗圭殑浼樺娍,鍦ㄩ槻娌葷溂閮ㄦ柊鐢熻綆℃，

本文編號：1602628