本文選題：普通脂質(zhì)微泡　切入點(diǎn)：陽離子脂質(zhì)微泡　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分普通脂質(zhì)及陽離子微泡制備及性能檢測(cè)目的構(gòu)建普通脂質(zhì)微泡(NMB)、陽離子微泡(CMB),并檢測(cè)其基本物理特征；比較NMB和CMB攜載內(nèi)皮抑素質(zhì)粒(pEZ-M46-ES)的能力。方法采用機(jī)械震蕩法構(gòu)建兩種不同的脂質(zhì)微泡,通過在成膜材料中加入DC-膽固醇(DC-cholesterol)使微泡表面帶正電荷從而構(gòu)建陽離子微泡(CMB),光鏡下觀察不同微泡基本形態(tài),并檢測(cè)其濃度、粒徑、表面電位及載基因能力等基本特性。結(jié)果NMB、CMB均成功構(gòu)建,光鏡下大小均一,分散度較好；其表面電荷、粒徑及濃度分別為+25.62±4.38 mV,1.64±0.28μm,4.16±0.18×109/ml。固定微泡的濃度為5×108/ml,兩者的載基因量分別為2.01±0.74μg和19.02±0.76μg。結(jié)論NMB及CMB制備成功。第二部分超聲輻照陽離子微泡介導(dǎo)內(nèi)皮抑素基因轉(zhuǎn)染人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞目的研究NMB、CMB攜內(nèi)皮抑素質(zhì)粒在超聲作用下轉(zhuǎn)染HRECs細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率,以及對(duì)細(xì)胞周期、體外血管成型及細(xì)胞遷移的影響。并與脂質(zhì)體載體進(jìn)行對(duì)比。方法實(shí)驗(yàn)分組：①空白對(duì)照組(C)②質(zhì)粒+普通離子微泡+超聲輻照組(NMB)③質(zhì)粒+脂質(zhì)體組(L)④質(zhì)粒+陽離子微泡+超聲輻照組(CMB)。①組以空白對(duì)照組,②組以超聲輻照普通微泡介導(dǎo)內(nèi)皮抑素基因轉(zhuǎn)染作為陽性對(duì)照,③組以脂質(zhì)體2000介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染作為陽性對(duì)照,④組以超聲輻照陽離子微泡介導(dǎo)內(nèi)皮抑素基因進(jìn)行轉(zhuǎn)染。超聲(1 MHz,1 W/cm2, and 50% duty cycle (DC),30 seconds)作用下轉(zhuǎn)染HRECs,轉(zhuǎn)染后收集細(xì)胞行流式細(xì)胞檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞周期,qPCR及Western-blot分別檢測(cè)endostatin, VEGF. bcl-2和bcl-xl mRNA及蛋白表達(dá)情況,通過體外血管成型及細(xì)胞遷移評(píng)價(jià)內(nèi)皮抑素質(zhì)粒在不同載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染后的治療效果。結(jié)果 各組轉(zhuǎn)染pEZ-M46-ES質(zhì)粒后24h基因轉(zhuǎn)染率分別為：1.20±0.21%,28.25±0.57%,30.74±7.50%和41.8±8.90%；轉(zhuǎn)染后24h及48h流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期顯示CMB組處于G1期的細(xì)胞較其他各組明顯增多；MTT檢測(cè)結(jié)果顯示CMB組對(duì)HRECs的生長曲線較其他各組有明顯抑制作用；qPCR及Western blot檢測(cè)顯示CMB組endostatin mRNA及蛋白表達(dá)較其他各組明顯增加,而VEGF、bcl-2和bcl-xl的mRNA及蛋白表達(dá)較其他各組明顯減少；各組HRECs形成網(wǎng)狀新生血管的數(shù)量分別為26.47±3.52,15.17±1.52,13.19±3.43,8.42±1.02個(gè)；各組HREC細(xì)胞遷移數(shù)量分別為：30±1.57,22.4±2.07,21.6±2.17,15.4±2.7個(gè)。結(jié)論與普通脂質(zhì)微泡和脂質(zhì)體作為基因載體相比,CMB組基因轉(zhuǎn)染效率明顯提高；普通脂質(zhì)微泡與脂質(zhì)體也可增加基因轉(zhuǎn)染效率,但兩者基因轉(zhuǎn)染效率無明顯差別。超聲輻照微泡介導(dǎo)內(nèi)皮抑素基因轉(zhuǎn)染HRECs,可明顯抑制體外血管成型及細(xì)胞生長、增殖及遷移。第三部分 內(nèi)皮抑素基因?qū)π∈笠暰W(wǎng)膜新生血管的抑制作用目的分別以脂質(zhì)體、普通微泡和陽離子微泡作為基因載體,后兩者聯(lián)合超聲輻照,介導(dǎo)內(nèi)皮抑素基因轉(zhuǎn)染小鼠視網(wǎng)膜,比較其抑制新生血管的效果并探討其可能機(jī)制。方法分別將普通微泡,脂質(zhì)體及陽離子微泡與pEZ-M46-ES質(zhì)粒進(jìn)行孵育,得到載基因的脂質(zhì)體或微泡。采用高濃度氧誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠建立OIR (Oxygen-inducedretinopathy,氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變)動(dòng)物模型。將60只視網(wǎng)膜新生血管模型小鼠,隨機(jī)分為以下3組：①質(zhì)粒+普通離子微泡+超聲輻照組(NMB)②質(zhì)粒+脂質(zhì)體組(L)③質(zhì)粒+陽離子微泡+超聲輻照組(CMB)。①組以超聲輻照普通微泡介導(dǎo)內(nèi)皮抑素基因轉(zhuǎn)染,②組以脂質(zhì)體2000介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染,③組以超聲輻照陽離子微泡介導(dǎo)內(nèi)皮抑素基因轉(zhuǎn)染。小鼠視網(wǎng)膜新生血管模型建造后用微量注射器按以上分組右眼玻璃體腔注射基因及載體復(fù)合物2μl,①、③組在注射后立即使用超聲輻照眼球。左眼作為對(duì)照組(C)。于注射后5天行視網(wǎng)膜組織切片HE染色計(jì)數(shù)突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)目；注射后5、14、28d激光共聚焦顯微鏡下觀察各組pEZ-M46-ES的熒光表達(dá)強(qiáng)度,qPCR法檢測(cè)各組視網(wǎng)膜組織中endostatin、VEGF、bcl-2和bcl-xl mRNA的表達(dá)情況,Western blot法檢測(cè)各組視網(wǎng)膜組織中endostati、VEGF、bcl-2和bcl-xl的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果視網(wǎng)膜組織切片HE染色結(jié)果示CMB組小鼠突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)較其他各組顯著減少,各組細(xì)胞核個(gè)數(shù)分別為：41.7±6.1,26.1±1.4,23.1±3.5,16.4±1.2個(gè)。激光共聚焦顯微鏡下觀察并計(jì)算視網(wǎng)膜色素上皮層熒光強(qiáng)度所有數(shù)值的平均值,統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染后5及14d, NMB組、L組及CMB組的pEZ-M46-ES熒光表達(dá)強(qiáng)度均逐漸增強(qiáng),轉(zhuǎn)染后28d各組pEZ-M46-ES熒光表達(dá)強(qiáng)度較第14d減弱,CMB組與NMB組及L組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；NMB組與L組在轉(zhuǎn)染后5d及14d兩組之間的熒光表達(dá)強(qiáng)度無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但在轉(zhuǎn)染后28d, NMB組的pEZ-M46-ES熒光表達(dá)強(qiáng)度較L組強(qiáng),其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。視網(wǎng)膜組織qPCR及Western blot檢測(cè)顯示CMB組endostatin的mRNA及蛋白表達(dá)較其他各組明顯增加,而VEGF、bcl-2和bcl-xl的mRNA及蛋白表達(dá)較其他各組明顯減少。結(jié)論超聲輻照陽離子微泡介導(dǎo)內(nèi)皮抑素基因轉(zhuǎn)染與普通微泡及脂質(zhì)體相比可顯著加強(qiáng)對(duì)小鼠視網(wǎng)膜新生血管生成的抑制作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R774.1;R450

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本文編號(hào)：1596861