發(fā)布時(shí)間：2018-03-10 23:23

  本文選題：縫隙連接蛋白26　切入點(diǎn)：他莫昔芬　出處：《華中科技大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分Connexin26相關(guān)遲發(fā)性非綜合癥型遺傳性耳聾小鼠模型的建立及鑒定目的：建立及鑒定Connexin26相關(guān)遲發(fā)性非綜合癥型遺傳性耳聾小鼠模型。方法：使用Cx26loxp/loxP小鼠與Rosa26CreER小鼠雜交,最終獲得Cx261oxP/loxP; Rosa26CreER小鼠。在Cx26loxP/loxP; Rosa26CreER小鼠出生后第18天(Postnatal Day 18,P18)給予單次他莫昔芬(Tamoxifen,TMX)腹腔注射；以Cx26loxP/loxP小鼠出生后第18天給予單次他莫昔芬腹腔注射作為對(duì)照�；蚍中�(Genotyping)用來(lái)確定小鼠的基因型,蛋白印跡雜交(Western Blot)用來(lái)檢測(cè)小鼠耳蝸內(nèi)Cx26表達(dá)水平。聽(tīng)性腦干反應(yīng)(Auditory Brainstem Response,ABR)檢測(cè)小鼠聽(tīng)力。結(jié)果：蛋白印跡雜交結(jié)果顯示,敲除組小鼠1月齡時(shí)耳蝸Cx26表達(dá)量下降。ABR結(jié)果提示敲除組小鼠在1月齡時(shí)聽(tīng)力正常,5月齡時(shí)出現(xiàn)8-32KHz大于50dB SPL的聽(tīng)力損失。結(jié)論：我們成功地建立了Cx26相關(guān)遲發(fā)性非綜合癥型遺傳性耳聾小鼠模型。第二部分Connexin26相關(guān)遲發(fā)性非綜合癥型遺傳性耳聾小鼠對(duì)噪聲易感性的研究目的：研究Connexin26相關(guān)遲發(fā)性非綜合癥型遺傳性耳聾小鼠對(duì)噪聲的易感性。方法：將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為對(duì)照組、敲除組、噪聲組與敲除+噪聲組。其中對(duì)照組與噪聲組均使用Cx26loxP/loxP小鼠,而敲除組及敲除+噪聲組均使用Cx26loxP/loxP; Rosa26CreER小鼠。上述小鼠均在出生后第18天給予單次他莫昔芬腹腔注射,其中噪聲組與敲除+噪聲組在出生后第25天開(kāi)始給予噪聲暴露,刺激強(qiáng)度110dBSPL,每天8小時(shí),連續(xù)5天。在30日齡時(shí)采用蛋白印跡雜交(Western Blot)和免疫熒光技術(shù)(Immunofluorenscence)檢測(cè)耳蝸Cx26蛋白的表達(dá)水平。在30口齡與45口齡時(shí)采用聽(tīng)性腦干反應(yīng)(Auditory Brainstem Response,ABR)檢測(cè)小鼠的聽(tīng)閾。結(jié)果：蛋白印跡雜交和免疫熒光結(jié)果顯示,在30日齡時(shí)敲除組與敲除+噪聲組小鼠耳蝸Cx26表達(dá)下降。ABR結(jié)果顯示,在30日齡時(shí),對(duì)照組與敲除組小鼠聽(tīng)力未見(jiàn)明顯異常；噪聲組與敲除+噪聲組小鼠均表現(xiàn)為8-48KHz的重度聽(tīng)力損失。在45日齡時(shí),對(duì)照組與敲除組小鼠聽(tīng)力仍未見(jiàn)明顯異常；噪聲組小鼠8-32KHz聽(tīng)閾較30日齡時(shí)有所恢復(fù),而敲除+噪聲組小鼠聽(tīng)力無(wú)明顯恢復(fù)。結(jié)論： 出生后第18天敲除Cx26,在45日齡以前不會(huì)造成小鼠聽(tīng)力損傷。連續(xù)高強(qiáng)度噪聲刺激會(huì)對(duì)正常小鼠造成中-重度聽(tīng)力損傷,其8-32KHz聽(tīng)力損傷部分可逆；連續(xù)高強(qiáng)度噪聲刺激對(duì)遲發(fā)性Cx26敲除小鼠造成重度聽(tīng)力損傷,該聽(tīng)力損傷無(wú)法恢復(fù)。第三部分Connexin26相關(guān)遲發(fā)性非綜合癥型遺傳性耳聾小鼠模型聲損傷耳蝸細(xì)胞死亡模式的研究目的：探索Cx26相關(guān)遲發(fā)性非綜合癥型遺傳性耳聾小鼠模型聲損傷后耳蝸細(xì)胞死亡模式。方法：將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為對(duì)照組、敲除組、噪聲組與敲除+噪聲組。其中對(duì)照組與噪聲組均使用Cx26loxP/loxP小鼠,而敲除組及敲除+噪聲組均使用Cx261oxP/loxP; Rosa26CreER小鼠。上述小鼠均在出生后第18天給予單次他莫昔芬腹腔注射,其中噪聲組與敲除+噪聲組在出生后第25天給予噪聲暴露,刺激強(qiáng)度110dB SPL,每天8小時(shí),連續(xù)5天。在30 H齡與45日齡時(shí)采用基底膜鋪片定量分析毛細(xì)胞損傷,在45日齡時(shí)采用樹(shù)脂包埋軸位切片觀察耳蝸細(xì)胞損傷模式,透射電鏡觀察耳蝸血管紋細(xì)胞的超微病理變化。結(jié)果：在30日齡時(shí),對(duì)照組與敲除組小鼠毛細(xì)胞未見(jiàn)明顯缺失。噪聲組小鼠耳蝸底回出現(xiàn)最高達(dá)17.8%的外毛細(xì)胞缺失,而敲除+噪聲組小鼠耳蝸中至底回出現(xiàn)17.0%-56.1%的外毛細(xì)胞缺失；上述兩組小鼠內(nèi)毛細(xì)胞未見(jiàn)明顯缺失。在45口齡時(shí),對(duì)照組與敲除組小鼠毛細(xì)胞未見(jiàn)明顯缺失。噪聲組小鼠耳蝸外毛細(xì)胞損傷范圍稍有擴(kuò)大,底回出現(xiàn)最高達(dá)25.5%的外毛細(xì)胞缺失；敲除+噪聲組小鼠耳蝸中至底回出現(xiàn)17.6%-60.0%的外毛細(xì)胞缺失。半薄切片提示：上述四組小鼠耳蝸外側(cè)壁、血管紋與支持細(xì)胞光鏡下未見(jiàn)明顯異常。電鏡結(jié)果提示：敲除+噪聲組小鼠血管紋中間細(xì)胞線粒體形態(tài)異常。結(jié)論：出生后第18天敲除Cx26,在45日齡以前不會(huì)造成明顯的毛細(xì)胞缺失。連續(xù)高強(qiáng)度噪聲刺激會(huì)造成正常小鼠耳蝸底回少量外毛細(xì)胞缺失。連續(xù)高強(qiáng)度噪聲刺激對(duì)遲發(fā)性Cx26敲除小鼠造成中-底回部分外毛細(xì)胞缺失。連續(xù)高強(qiáng)度噪聲刺激后耳蝸血管紋中間細(xì)胞出現(xiàn)異常線粒體。第四部分出生后早期降低Connexin26表達(dá)對(duì)柱細(xì)胞微管的影響目的：探索出生后早期降低Connexin26表達(dá)對(duì)柱細(xì)胞微管的影響。方法：將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為對(duì)照組和敲除組：Cx26loxP/loxP小鼠及Cx26IoxP/1oxP; Rosa26CreER小鼠出生后第1天頸背部皮下注射他莫昔芬。在出生后第4天和第9天采用免疫熒光染色觀察敲除組與對(duì)照組耳蝸Cx26表達(dá)水平。出生后第9天和第18天半薄切片觀察耳蝸形態(tài)。透射電鏡觀察柱細(xì)胞超微病理變化。結(jié)果：免疫熒光結(jié)果顯示：敲除組小鼠出生后第4天及第9天耳蝸Cx26表達(dá)量較對(duì)照組降低。半薄切片結(jié)果顯示：出生后第9天對(duì)照組小鼠耳蝸?lái)斨械兹谻orti器發(fā)育良好,Corti隧道已開(kāi)放,Nuel間隙形成,而敲除組小鼠耳蝸?lái)斨械兹谻orti隧道均未能打開(kāi),Nuel間隙未能形成。敲除組小鼠在出生后第18天時(shí)耳蝸?lái)斨械兹谻orti隧道仍未能打開(kāi),Nuel司隙仍未形成。敲除組小鼠耳蝸基底膜中回與底回可見(jiàn)Corti器支持細(xì)胞與毛細(xì)胞缺失,外側(cè)壁與血管紋光鏡下結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯異常。透射電鏡觀察結(jié)果：出生后第9天對(duì)照組耳蝸柱細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大量呈束狀排列微管,其間可見(jiàn)線粒體,而敲除組小鼠耳蝸柱細(xì)胞中僅有少量微管排列。結(jié)論：出生后第1天降低耳蝸Cx26表達(dá)后,耳蝸Corti隧道不能開(kāi)放,柱細(xì)胞內(nèi)微管數(shù)量減少。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R764.43;R-332

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本文編號(hào)：1595530