本文選題：鼻咽癌　切入點(diǎn)：腫瘤干細(xì)胞　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景 鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是發(fā)生于鼻咽粘膜的惡性腫瘤,好發(fā)于中國華南地區(qū),每100,000人大約有25-50人發(fā)病。鼻咽癌的發(fā)病同EBV病毒感染,遺傳易感性以及接觸某些化學(xué)致癌物有關(guān)。在過去的幾十年里,鼻咽癌的診斷和治療手段逐步提高,但I(xiàn)V期鼻咽癌5年生存率僅有30%,局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移導(dǎo)致預(yù)后不良。 當(dāng)前越來越多的證據(jù)顯示腫瘤起源于腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells, CSCs),它是一類未分化細(xì)胞,具有自我更新、無限增殖和分化的能力,能促使腫瘤組織形成和無限生長,CSCs往往對(duì)化療抵抗并導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。因此,殺傷腫瘤干細(xì)胞對(duì)于成功治療腫瘤至關(guān)重要。 目前分離和鑒定腫瘤干細(xì)胞主要有如下幾種方式：1.特異性細(xì)胞表面標(biāo)記,細(xì)胞表面蛋白如CD24、CD44、CD133和一些胚胎干細(xì)胞標(biāo)記物也廣泛應(yīng)用于鑒定腫瘤干細(xì)胞；2.側(cè)群細(xì)胞,利用DNA染料Hoechst33342染料和流式細(xì)胞術(shù)分選,它們依賴ABCG2分子的表達(dá)將DNA特異性染料Hoechst33342泵出細(xì)胞外,目前已有報(bào)道表明SP可應(yīng)用于鑒別和分選鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞；3.腫瘤球培養(yǎng),含EGF、bFGF無血清培養(yǎng)基可以促進(jìn)正常干細(xì)胞的體外擴(kuò)增而不發(fā)生分化,通過無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)形成腫瘤細(xì)胞球可以用來富集腫瘤干細(xì)胞；4.PKH26標(biāo)記,一種親脂性的紅色熒光染料,可與細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層不可逆結(jié)合,已有報(bào)道PKH26可標(biāo)記靜止期細(xì)胞,可作為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記,PKH26陽性細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞性質(zhì)；5.乙醛脫氫酶(ALDH),已經(jīng)被報(bào)道可用作為腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)記物,乙醛脫氫酶催化乙醛氧化成羧酸,在生物體內(nèi)外的代謝中扮演著重要角色,已有報(bào)道稱ALDH可作為多種腫瘤的干細(xì)胞標(biāo)記物。 目前已有許多研究表明腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移同腫瘤干細(xì)胞密切相關(guān),傳統(tǒng)的化療藥物只能殺傷非干細(xì)胞,腫瘤干細(xì)胞假說為超越傳統(tǒng)抗增殖藥物的治療策略的合理性奠定理論基礎(chǔ)。當(dāng)前抑制腫瘤干細(xì)胞的策略主要包括：1.阻斷自我更新信號(hào)通路；2.逆轉(zhuǎn)其多藥耐藥性；3.誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化；4.影響調(diào)節(jié)干細(xì)胞的microRAN表達(dá)。有報(bào)道將EMT,腫瘤干細(xì)胞和腫瘤耐藥三者比喻為腫瘤發(fā)生過程中的邪惡軸心(axis of evil),三者可互相轉(zhuǎn)化,microRNA在調(diào)節(jié)三者之間關(guān)系中發(fā)揮著最重要的作用。 長期以來,人們一直期望能找到一種能特異性地抑制CSCs的藥物。但是由于CSCs在腫瘤細(xì)胞群中分布之稀少,以及體外培養(yǎng)時(shí)的不穩(wěn)定性,使得尋找這樣一種藥物的目標(biāo)遠(yuǎn)不可及。當(dāng)前的觀點(diǎn)認(rèn)為普通化療藥物只能殺傷占腫瘤絕大部分的非腫瘤干細(xì)胞,而難以殺傷腫瘤干細(xì)胞,只有聯(lián)合使用特異性針對(duì)腫瘤干細(xì)胞的藥物才有望徹底消除腫瘤。 鹽霉素是一種羧酸聚醚類抗生素,主要用于防止白色鏈霉菌引起的雞球蟲病,當(dāng)前有報(bào)道稱鹽霉素具有抑制腫瘤干細(xì)胞作用,鹽霉素抑制乳腺癌干細(xì)胞的效力比普通抗癌藥物泰克索高100倍。 本研究以常規(guī)化療藥物順鉑作為對(duì)照,研究了鹽霉素對(duì)鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞的作用。通過側(cè)群分析,Aldefluor檢測(cè)以及腫瘤球形成實(shí)驗(yàn)證明了鹽霉素可以有效抑制鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞。此外,證實(shí)了鹽霉素可通過調(diào)節(jié)miRNA-200c發(fā)揮其抑制腫瘤干細(xì)胞的作用。本研究為鹽霉素抑制腫瘤干細(xì)胞的作用機(jī)制提供了重要的結(jié)論。 研究目的 1.驗(yàn)證鼻咽癌腫瘤球干細(xì)胞特性； 2.檢測(cè)鹽霉素抗鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞效應(yīng)； 3.研究鹽霉素抗腫瘤干細(xì)胞分子機(jī)制。 方法 細(xì)胞和培養(yǎng)條件： 本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存。人鼻咽癌細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,青霉素100U/ml,鏈霉素100μg/ml,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。 腫瘤球培養(yǎng)和分化實(shí)驗(yàn)： 無血清培養(yǎng)基配制：無血清培養(yǎng)基(serum free medium,SFM)由Ham's DMEM-F12(1:1)、B27(1:50)、EGF(20ng/ml)、bFGF(20ng/ml)組成,將鼻咽癌SUNE-1,5-8F細(xì)胞接種于10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期,用PBS液清洗,胰酶消化,消化后再用PBS清洗兩次,置于低粘附培養(yǎng)板中,懸浮于SFM中進(jìn)行傳代培養(yǎng),觀察細(xì)胞在SFM中形成腫瘤干細(xì)胞球的過程,將于SFM中形成的細(xì)胞球重新置于SSM中誘導(dǎo)其分化,48h后倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。 免疫熒光： 吸取SFM中形成的腫瘤球至24孔板中(腫瘤球樣品),或吸取SFM中形成的腫瘤球植入預(yù)先放有蓋玻片的6孔板中(腫瘤球分化樣品),4%多聚甲醛固定,PBS清洗,0.2%Triton X-100破膜,PBS清洗,加入一抗37℃孵育45min,PBS清洗,洗滌后加入熒光二抗,37℃孵育45min,PBS清洗,DAPI染細(xì)胞核,在共聚焦顯微鏡下觀察。10×KB配方：0.1M Tris,pH7.5；1.5M NaCl；1.0%BSA。 MTT檢測(cè)： 過濾網(wǎng)將大于40μm的腫瘤球分離出來分離成單個(gè)細(xì)胞或?qū)?duì)數(shù)生長期的貼壁細(xì)胞分別接種到96孔板中,每孔2000個(gè)細(xì)胞,37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h,依濃度梯度加入藥物。藥物作用完畢后每孔加20μl MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4～5h,將細(xì)胞培養(yǎng)液上清棄去,每孔加入200μl DMSO,搖床混勻約5min。酶標(biāo)儀490nm比色,繪制腫瘤細(xì)胞生長曲線。 側(cè)群細(xì)胞檢測(cè)： 將貼壁細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞分離成單個(gè)細(xì)胞,離心后用PBS清洗,含2%胎牛血清的1640培基重懸,用Hoechst33342標(biāo)記,標(biāo)記的細(xì)胞在37℃孵育90min, PBS洗滌,重懸,檢測(cè)前加入Propidium Iodide標(biāo)記死細(xì)胞,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)側(cè)群比例。 Aldefluor檢測(cè)： 將貼壁細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞分離成單個(gè)細(xì)胞,將細(xì)胞懸浮于反應(yīng)緩沖液中,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL,測(cè)定管中細(xì)胞懸液總體積1mL,向測(cè)定管中加入激活A(yù)LDH的底物溶液,對(duì)照管中加入ALDH特定抑制物DEAB溶液,取出測(cè)定管中500μL細(xì)胞懸液加入對(duì)照管中,混勻,將測(cè)定管和對(duì)照管置于37℃孵育40min.離心洗滌后PBS重懸,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。 免疫印跡檢測(cè)： 蛋白質(zhì)在SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行分析,將分離的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上,PVDF膜浸泡在封閉液中25℃2h,一抗4℃孵育過夜,PVDF膜與二抗在室溫下孵育1h,采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)。 細(xì)胞轉(zhuǎn)染： 細(xì)胞接種在6孔板內(nèi),待50%細(xì)胞匯合后,用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑,并在室溫孵育10min,在Opti-MEM培養(yǎng)基中稀釋miR-200c抑制物及陰性對(duì)照,混合稀釋的miR-200c抑制物/NC和稀釋的Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑,室溫孵育10min,將混合物加入培養(yǎng)基中,置于37℃,5%CO2孵箱中培養(yǎng)。 RNA提取： 細(xì)胞總RNA提�。杭�(xì)胞消化,離心,棄上清,加入1ml Trizol;室溫孵育15min,裂解細(xì)胞；4℃,12000rpm離心15min,取上清；每1ml Trizol加入0.2ml氯仿,劇烈振蕩15s,冰上孵育15min；4℃,12000rpm離心15min,緩慢取上清,避免吸入中間層的白色物質(zhì),上層水相體積約為所用Trizol試劑的60%；將吸取的上清置于另一干凈EP管內(nèi),加入等體積的異丙醇沉淀水樣中的RNA,顛倒混勻,4℃,12000rpm離心15min,見RNA沉淀附著于EP管底和側(cè)壁；棄上清,用預(yù)冷的75%乙醇(1%DEPC水配制)1ml懸浮洗滌沉淀；4℃,7500g離心5min,干燥RNA,用DEPC水溶解沉淀,-80℃保存。 免疫組織化學(xué)： 石蠟切片經(jīng)脫蠟,乙醇梯度水化,抗原修復(fù),滅活內(nèi)源性過氧化物酶,一抗4℃孵育過夜,二抗25℃孵育10mmin,DAB顯色,顯微鏡觀察顯色,蘇木素復(fù)染核,鹽酸乙醇分化,脫水,透明。 體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)：： 接種時(shí)細(xì)胞用100μl按1:1DMEM和Matrigel懸浮,觀察其成瘤情況如下,記錄小鼠腫瘤發(fā)生的時(shí)間；根據(jù)公式V=1/2ab2(a為長徑,b為短徑)計(jì)算腫瘤體積,繪制腫瘤成長曲線,腫瘤生長數(shù)周后處死動(dòng)物取出腫瘤組織。 本課題所用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法： 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。兩組腫瘤體積比較采用兩獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)；腫瘤球形成及直徑,ALDH陽性細(xì)胞和側(cè)群比例,凋亡檢測(cè),動(dòng)物成瘤時(shí)間以及原代細(xì)胞腫瘤球數(shù)量數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析(One-way ANOVA)比較各組差異,如方差齊性,多重比較采用LSD法；如方差不齊,采用Welch值,多重比較采用Dunnett T3法；在體腫瘤生長曲線的比較采用兩因素方差分析(two-way ANOVA)比較各組間差異。P0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)果 1.培養(yǎng)和鑒定鼻咽癌腫瘤球 (1)免疫熒光和western blot檢測(cè)結(jié)果顯示腫瘤球高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物Oct3/4, Bmi-1, Nanog, Sox2, EpCAM和間充質(zhì)標(biāo)記物vimentin,低表達(dá)上皮標(biāo)記物CK5/6；腫瘤球分化后高表達(dá)CK5/6； (2)單個(gè)PKH26陽性的細(xì)胞可形成腫瘤球,PKH26陽性細(xì)胞可代表腫瘤干細(xì)胞；免疫熒光結(jié)果顯示腫瘤球有少量細(xì)胞同時(shí)表達(dá)PKH26和干細(xì)胞標(biāo)記Sox2,CD133和ABCG2; (3)腫瘤球細(xì)胞(18.1%,31.9%)ALDH+細(xì)胞比例較分化細(xì)胞(1.0%,1.6%)增高；腫瘤球細(xì)胞(6.1%)SP細(xì)胞比例較分化細(xì)胞(2.3%)增高； (4)腫瘤球細(xì)胞較分化細(xì)胞增殖速度快；腫瘤球細(xì)胞耐藥性(cisplatin)較分化細(xì)胞強(qiáng)(IC505倍)； (5)腫瘤球細(xì)胞成瘤能力較分化細(xì)胞強(qiáng),1×104個(gè)腫瘤球細(xì)胞接種3只裸鼠,2只成瘤,1×104個(gè)分化細(xì)胞接種裸鼠無腫瘤形成。 2. Salinomycin抑制鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞的作用 (1) Salinomycin處理組較未處理組和cisplatin處理組腫瘤球形成率低(P=0.000),腫瘤球體積小(P=0.000)； (2)腫瘤球細(xì)胞對(duì)salinomycin較cisplatin敏感(IC505倍),分化細(xì)胞對(duì)salinomycin和cisplatin敏感性無明顯差異； (3) Cisplatin處理組可增加細(xì)胞SP比例,salinomycin處理組可降低細(xì)胞SP比例；salinomycin抑制腫瘤球ALDH陽性細(xì)胞比例(2μM, P=0.005;5μM, P=0.003), cisplatin無抑制作用(P=0.421)； (4) Salinomycin處理細(xì)胞后c-myc, Oct3/4, Nanog蛋白表達(dá)降低； (5) Salinomycin抑制體內(nèi)腫瘤生長較cisplatin作用顯著(P=0.000)；salinomycin較cisplatin可顯著推遲腫瘤形成時(shí)間(P=0.011)； (6) Salinomycin治療組原代細(xì)胞較cisplatin治療組SP比例低(0.9%vs.2.1%),ALDH陽性細(xì)胞比例較低(0.9%vs.8.6%),成球率低(P=0.000)； (7) Salinomycin治療組動(dòng)物成瘤組織壞死明顯；Salinomycin治療組高表達(dá)E-cadherin,低表達(dá)vimentin和Oct3/4。 3. Salinomycin選擇性抑制腫瘤干細(xì)胞分子機(jī)制研究 (1) Salinomycin處理組細(xì)胞表達(dá)E-cadherin較高,vimentin, SUZ12和：Slug較低； (2)相對(duì)于CNE-2細(xì)胞,C-666和6-10B細(xì)胞表達(dá)較高ABCG2,相應(yīng)地,C666和6-10B細(xì)胞對(duì)salinomycin較CNE-2細(xì)胞敏感；Salinomycin可抑制ABCG2和p-glycoprotein的表達(dá)； (3) Salinomycin可抑制P-catenin, cyclin D1和P-AKT表達(dá)； (4)隨著salinomycin濃度增加,細(xì)胞凋亡比例逐漸增加(P0.05)。 4. Salinomycin通過調(diào)節(jié)miR-200c抑制腫瘤干細(xì)胞 (1) Salinomycin處理細(xì)胞后提高了miR-200c(10倍)； (2) miR-200c-inhibitor可提高細(xì)胞SP比例和腫瘤球形成能力,miR200c-inhibitor可拮抗salinomycin抑制SP的作用(P=0.013)和抑制腫瘤球形成的能力(P=0.001)； (3) miR-200c-inhibitor可降低細(xì)胞對(duì)cisplatin的敏感性,可增加對(duì)salinomycin的敏感性； (4)細(xì)胞經(jīng)miR-200c-inhibitor處理可增加干細(xì)胞標(biāo)記物SUZ12和Bmi-1表達(dá),聯(lián)合salinomycin處理可拮抗：niR-200c-inhibitor作用。 結(jié)論 1.鼻咽癌腫瘤球細(xì)胞具有干細(xì)胞特性,表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物并具有高致瘤性； 2. Salinomycin可選擇性抑制鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞,主要通過抑制EMT發(fā)生,抑制Wnt/p-catenin通路,下調(diào)多藥耐藥基因發(fā)揮作用； 3. Salinomycin可通過上調(diào)miR-200c抑制靶蛋白進(jìn)而抑制腫瘤干細(xì)胞。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R739.63

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9 張e，

本文編號(hào)：1562444