本文關(guān)鍵詞： Caveolin-1 RNA干擾 慢病毒 下咽 鱗狀細胞癌　出處：《山東大學》2012年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：前言 下咽鱗狀細胞癌是耳鼻咽喉頭頸外科最常見的惡性腫瘤之一,具有發(fā)生位置隱蔽、浸潤性極強、易粘膜下擴散、原發(fā)病變呈多中心生長的特點。因早期無明顯的癥狀、缺乏特異性體征和可靠的診斷措施,所以,多數(shù)患者在臨床確診并接受治療時,已屬于晚期,病變常累及喉腔、頸段食道和舌根等器官；同時,由于喉咽部淋巴管豐富,極易發(fā)生頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和包膜外擴散,并侵犯周圍組織器官,如頸動脈等重要的血管,所以,下咽鱗癌是頭頸部預后最差的惡性腫瘤之一。由于下咽癌生長部位的特殊性,手術(shù)治療后,可能導致語言、呼吸及吞咽器官的功能障礙,嚴重影響患者的生存質(zhì)量；而放療和化療又存在治療不徹底、并發(fā)癥多、患者痛苦較大等問題。因此,盡快在分子生物學的基礎(chǔ)上提出新的診斷方法和簡便有效、毒副作用小的治療手段就成為亟須解決的課題。 生物膜是細胞生命活動的主要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),與細胞的惡性轉(zhuǎn)化及腫瘤的演進密切相關(guān)。上個世紀50年代,Yamada用電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)并命名了細胞質(zhì)膜微囊—Caveolae;1972年,Singer和Nicolson提出“液相雙層脂質(zhì)鑲嵌模型”；20世紀90年代研究發(fā)現(xiàn)：細胞膜的雙層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)是不均一的,結(jié)構(gòu)蛋白Caveolin與某些富含膽固醇和鞘脂的微區(qū)域的結(jié)構(gòu)變化密切相關(guān),這些區(qū)域被稱為脂筏,無結(jié)構(gòu)蛋白時呈平板狀,脂筏與Caveolin結(jié)合后形成的燒瓶狀膜結(jié)構(gòu)即Caveolae。 Caveolin-1(CAV1)是Caveolae的標志性蛋白,為分子量約22kd的膜內(nèi)蛋白質(zhì),其基因位于7q31.1,是形成燒瓶狀結(jié)構(gòu)Caveolae的必需成分。目前,CAV1與腫瘤形成之間的關(guān)系已成為研究的熱點。 研究證實：在大多數(shù)腫瘤細胞中,如乳腺癌、肺癌、宮頸癌、卵巢癌、肉瘤,CAV1表達下降,為抑癌基因；但在某些腫瘤,如甲狀腺濾泡狀癌中沒有CAV1的表達；而在前列腺癌、胰腺導管腺癌及食道鱗狀細胞癌中其表達水平上調(diào),提示：在這些癌的形成過程中,CAV1是作為腫瘤促進因子。因此,CAV1在腫瘤中的作用可能與組織相關(guān)。 在本課題中,我們成功構(gòu)建了CAV1-小干擾RNA-慢病毒載體,通過感染下咽癌FaDu細胞株,進而檢測CAV1對該細胞株體外生長的作用；并成功構(gòu)建下咽鱗狀細胞癌FaDu細胞株移植瘤動物模型,通過定期瘤體注射CAV1-小干擾RNA-慢病毒載體,以及后期對腫瘤組織的檢測來研究CAVl對FaDu細胞株體內(nèi)生長的作用。 目的 構(gòu)建人CAV1-小干擾RNA-慢病毒載體(CAV1-RNAi-lentivirus)并轉(zhuǎn)染下咽鱗狀細胞癌FaDu細胞株,篩選獲得穩(wěn)定干擾CAV1表達的FaDu細胞。進而探討CAV1-RNAi-lentivirus對人下咽鱗狀細胞癌FaDu細胞株體內(nèi)和體外生長的影響。 方法 1.構(gòu)建人CAV1-RNA干擾慢病毒載體。設(shè)計針對CAVl的shRNA序列,Age Ⅰ和EcoRⅠ進行載體質(zhì)粒雙酶切,應(yīng)用基因重組技術(shù)插入pGCSL-GFP慢病毒表達載體中,RT-PCR和DNA測序鑒定重組克隆。重組病毒質(zhì)粒及其3種輔助包裝原件載體質(zhì)粒通過Lipofectamine TM2000共轉(zhuǎn)染293T細胞,培養(yǎng)48h后,收集細胞培養(yǎng)上清液,將其濃縮后在293T細胞中測定病毒滴度,并進行大量包裝和備用細胞轉(zhuǎn)染。 2. CAV1-RNAi-lentivirus對FaDu細胞體外生長的作用。應(yīng)用CAV1-RNAi-lentivirus轉(zhuǎn)染FaDu細胞,實驗設(shè)立pGCSL-GFP-空載體對照組(GFP-lentivirus)和空白對照組。確定G418的最佳篩選濃度,于轉(zhuǎn)染24h后,加入最佳篩選濃度的G418篩選穩(wěn)定干擾CAV1表達的細胞。待細胞生長成肉眼可見的克隆后,使用浸有胰酶的無菌濾紙片消化挑取克隆,擴增培養(yǎng)。熒光倒置顯微鏡下觀察并計算CAV1-RNAi-lentivirus的轉(zhuǎn)染效率。采用RT-PCR、Western-blot方法檢測細胞中CAV1的mRNA和蛋白水平的敲除效率。應(yīng)用原位末端標記法(TdT-mediated dUTPnick end labeling, TUNEL)檢測轉(zhuǎn)染CAV1-RNAi-lentivirus后FaDu細胞的體外凋亡情況。 3. CAV1-RNAi-lentivirus對FaDu細胞體內(nèi)生長的作用。構(gòu)建BALB/c-nude裸鼠下咽鱗狀細胞癌FaDu細胞株移植瘤模型,待腫瘤長至一定時間和體積時,將所有動物隨機分組。實驗設(shè)立GFP-lentivirus陰性對照組和空白對照組。給藥方法采用瘤周多點注射。實驗組動物每周定期瘤周注射CAV1-RNAi-lentivirus(1×107TU,0.1m1),陰性對照組動物注射GFP-lentivirus(1×107TU,0.1ml),空白對照組注射同劑量的PBS,并每隔4d測量各組所有動物的腫瘤最長徑與最短徑,計算腫瘤體積變化和抑制率。自注射時間起32d后,采用脫臼法處死實驗動物并取出移植瘤,測量標本體積并稱重。以RT-PCR.免疫組化等方法檢測三組腫瘤組織中目的基因CAV1的mRNA和蛋白表達變化情況,從而對CAV1-小干擾RNA-慢病毒載體在FaDu細胞株體內(nèi)生長的作用進行評價,并探討其可能的作用機制。 結(jié)果 1.RT-PCR和DNA測序鑒定重組克隆結(jié)果顯示,實驗采用基因重組技術(shù)成功構(gòu)建CAV1-小干擾RNA-慢病毒載體,命名為CAV1-RNAi-lentivirus,測定滴度為1×108U/ml。 2.將CAVl-小干擾RNA-慢病毒載體轉(zhuǎn)染下咽癌FaDu細胞,經(jīng)G418篩選,30天后獲得穩(wěn)定干擾CAV1表達的細胞,細胞轉(zhuǎn)染效率90%。運用RT-PCR檢測方法證實,與空白對照組(1.297±0.068)和陰性對照組(1.183±0.093)相比,RNA干擾組細胞的CAV1的mRNA表達明顯降低(0.47±0.050,P0.05),差異有統(tǒng)計學意義。Western-blot檢測結(jié)果表明,與空白對照組(0.973±0.117)和陰性對照組(0.83±0.091)相比,CAV1-RNAi-Lentivirus轉(zhuǎn)染組細胞的CAV1蛋白表達水平(0.43±0.098,P0.05)明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義。TUNEL檢測結(jié)果證實,與空白對照組(AI=5.55±0.47%)和陰性對照組(AI=7.52±1.90%)相比,CAV1-RNAi-Lentivirus轉(zhuǎn)染組(AI=22.39±2.61%,P0.05)細胞的凋亡指數(shù)明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義。 3.成功構(gòu)建BALB/c-nude裸鼠下咽鱗狀細胞癌FaDu細胞株移植瘤模型。定期注射CAV1-RNAi-Lentivirus組的裸鼠移植瘤平均重量和體積(1.24±0.42g,1.40±0.49cm3),均低于陰性對照組裸鼠移植瘤(1.79±0.42g,1.97±0.45cm3)和空白對照組移植瘤(1.88±0.54g,2.10±0.55cm3,P0.05)。抑瘤率分別為30.8%和34.0%。 對各組移植瘤進行的RT-PCR檢測結(jié)果證實,與空白對照組(1.348±0.031)和陰性對照組(1.175±0.055)相比,CAV1-RNAi-Lentivirus注射組腫瘤組織的CAV1mRNA(0.671±0.070,P0.05)表達水平降低,條帶亮度明顯減弱,差異有統(tǒng)計學意義。免疫組化染色結(jié)果顯示,雖然治療組移植瘤CAVl蛋白表達下降,但差異沒有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 結(jié)論 本研究結(jié)果表明,重組CAV1-RNAi-lentivirus在體外轉(zhuǎn)染下咽鱗狀細胞癌FaDu細胞株后,G418篩選30天后可以獲得穩(wěn)定干擾CAV1表達的細胞,RT-PCR和Western-blot檢測方法驗證了基因的敲除效率。TUNEL實驗結(jié)果顯示,體外培養(yǎng)過程中,下調(diào)CAV1基因的表達,FaDu細胞的凋亡比對照組明顯增加。實驗成功構(gòu)建BALB/c-nude裸鼠下咽鱗狀細胞癌FaDu細胞株移植瘤模型,待腫瘤長至一定體積后,應(yīng)用CAV1-RNAi-lentivirus定期瘤內(nèi)多點注射,可以減緩腫瘤組織的生長,即FaDu細胞在體內(nèi)的生長增殖受到抑制。以上實驗結(jié)果提示,CAV1在下咽鱗狀細胞癌FaDu細胞株的生長過程中可能起腫瘤促進因子的作用,下調(diào)CAV1的表達可能成為FaDu細胞形成的下咽癌的治療方法之一。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R739.6

【參考文獻】

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本文編號：1550897