本文關(guān)鍵詞： 視錐細(xì)胞 視網(wǎng)膜色素變性 PI3K/AKT mTOR 神經(jīng)保護(hù)作用　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的光感受器細(xì)胞是人體內(nèi)代謝最為活躍的細(xì)胞之一,其代謝的平衡主要依賴于細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT/m TOR調(diào)節(jié)通路。近年來研究顯示,光感受器細(xì)胞代謝失衡所引起的細(xì)胞自噬可能與多種眼底變性疾病的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。本研究聚焦于對(duì)人類視覺質(zhì)量至關(guān)重要的視錐細(xì)胞,通過對(duì)其特異性敲除m TOR通路中PTEN、TSC1、RAPTOR、RICTOR等若干重要的調(diào)節(jié)因子,觀察視網(wǎng)膜色素變性及正常小鼠視錐細(xì)胞形態(tài)、及功能的改變,初步探討m TOR通路在病變及正常視錐細(xì)胞中的調(diào)節(jié)作用。方法1.利用中波長視蛋白為啟動(dòng)子的M-Cre重組酶系統(tǒng),建立視錐細(xì)胞特異性目標(biāo)基因敲除小鼠種系:①目的基因的確立:通過敲除腫瘤抑制基因磷酸酶張力蛋白基因Pten實(shí)現(xiàn)對(duì)AKT/m TOR通路的持續(xù)性激活;通過敲除結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合物基因Tsc1,持續(xù)性激活m TORC1;通過敲除編碼m TORC1復(fù)合物的重要組成RAPTOR蛋白的基因Raptor實(shí)現(xiàn)m TORC1功能缺失;通過敲除編碼m TORC2復(fù)合物的重要組成RICTOR蛋白的基因Rictor實(shí)現(xiàn)m TORC2功能缺失;通過同時(shí)敲除Raptor及Rictor基因,實(shí)現(xiàn)m TORC1及m TORC2功能共同缺失。②將表達(dá)M-Cre的小鼠與攜帶目的基因Lox P位點(diǎn)的C57Bl6小鼠雜交以獲得正常視錐細(xì)胞特異性目標(biāo)基因敲除小鼠系Targetc/c,MCre+(Targetc KO)及其對(duì)照組Targetc/c,MCre-。③將Targetc/c,MCre+小鼠與Pde6b / (rd1)視網(wǎng)膜色素變性小鼠進(jìn)行雜交,以獲得有視網(wǎng)膜色素變性背景的視錐細(xì)胞目標(biāo)基因敲除小鼠系rd1,Targetc/c,MCre+(rd1_Targetc KO)及其對(duì)照組。④雙基因敲除小鼠種系的建立:經(jīng)多次雜交獲得Target1c/c,Target2c/c,MCre+;rd1,Target1c/c,Target2c/c,MCre+及其相應(yīng)對(duì)照組小鼠。⑤視紫紅質(zhì)基因敲除小鼠(Rho-/-)用于驗(yàn)證本文闡述的機(jī)制是否適用于其他視網(wǎng)膜色素變性模型。2.鼠尾組織DNA提取物PCR用于小鼠基因型的鑒定。3.表達(dá)td Tomato自發(fā)熒光蛋白的Ai9 Cre報(bào)道基因系用于驗(yàn)證MCre+視錐細(xì)胞在全視網(wǎng)膜中均勻分布。4.視網(wǎng)膜平鋪片和/或冰凍切片免疫組織化學(xué)染色,檢測(cè)視錐細(xì)胞形態(tài)、存留率、視錐細(xì)胞特異性蛋白表達(dá)量及AKT/m TOR通路中相關(guān)蛋白表達(dá)量的改變。5.Western Blot免疫印跡法用于定量檢測(cè)目的基因敲除組AKT/m TOR通路中相關(guān)蛋白表達(dá)量的改變。6.實(shí)時(shí)定量PCR(q RT-PCR)用于檢測(cè)AKT/m TOR通路中相關(guān)基因含量的改變。7.全視網(wǎng)膜組織NADPH定量分析技術(shù)用于檢測(cè)rd1,Tsc1c/c,MCre+及其對(duì)照組小鼠視網(wǎng)膜中NADPH水平。8.對(duì)rd1小鼠敲除Casp2基因,以驗(yàn)證NADPH水平對(duì)疾病狀態(tài)下視錐細(xì)胞的重要性。9.明視視網(wǎng)膜電圖(Photopic Electroretinogram,photopic ERG)用于對(duì)視錐細(xì)胞功能進(jìn)行檢測(cè)。10.眼底照相用于觀察各組小鼠眼底大體情況。11.掃描電鏡用于觀察各組小鼠光感受器細(xì)胞層及視網(wǎng)膜色素上皮層區(qū)域超微結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果I.成功建立各基因敲除小鼠系;MCre視錐細(xì)胞在全視網(wǎng)膜均勻分布。II.視網(wǎng)膜色素變性小鼠組1.視網(wǎng)膜平鋪片聯(lián)合視錐細(xì)胞特異性蛋白免疫組化染色,視錐細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示:①rd1_Ptenc KO小鼠視錐細(xì)胞存留率于出生后2月、4月、8月均顯著高于對(duì)照組(p0.05);出生后2個(gè)月rd1_Ptenc KO,Raptorc KO及rd1_Raptorc KO小鼠視錐細(xì)胞存留率均明顯低于對(duì)照組(p0.05);rd1_Rictorc KO小鼠視錐細(xì)胞存留率仍高于對(duì)照組(p0.05);②rd1_Tsc1c KO小鼠視錐細(xì)胞存留率于出生后2月、4月、8月均顯著高于對(duì)照組(p0.05);出生后2個(gè)月rd1_Tsc1c KO,Raptorc KO小鼠視錐細(xì)胞存留率均明顯低于對(duì)照組(p0.05);rd1_Tsc1c KO,Rictorc KO小鼠視錐細(xì)胞存留率仍高于對(duì)照組(p0.05)。2.明視ERG結(jié)果:出生后21天及2個(gè)月rd1_Tsc1c KO小鼠視錐細(xì)胞功能均顯著高于視網(wǎng)膜色素變性對(duì)照組(p0.05)。3.視網(wǎng)膜平鋪聯(lián)合AKT/m TOR通路相關(guān)磷酸化蛋白免疫組化染色顯示:①rd1,Ptenc/c,MCre+小鼠視網(wǎng)膜p-AKT-Thr308、p-S6陽性視錐細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)照組;p-AKT-Ser473、p-SGK-1陽性視錐細(xì)胞數(shù)低于對(duì)照組;②rd1_Tsc1c KO小鼠p-S6陽性視錐細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)照組,且與rd1_Ptenc KO小鼠視網(wǎng)膜相比p-S6陽性視錐細(xì)胞更廣泛和均一。4.視網(wǎng)膜平鋪聯(lián)合細(xì)胞增殖標(biāo)記蛋白Ki-67免疫組化染色顯示:rd1_Tsc1c KO小鼠視網(wǎng)膜未見Ki-67Ki-67陽性細(xì)胞。5.視網(wǎng)膜平鋪聯(lián)合m TOR通路下游代謝相關(guān)蛋白免疫組化染色顯示:與對(duì)照組相比rd1_Tsc1c KO小鼠視網(wǎng)膜中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT1),己糖激酶-II(HKII),葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD),丙酮酸激酶-2(PKM2),蘋果酸脫氫酶-1(ME1),低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)等表達(dá)量均顯著增加;在rd1_Tsc1c KO,Raptorc KO小鼠視網(wǎng)膜中未見上述蛋白表達(dá)量的增加。6.全視網(wǎng)膜組織NADPH定量分析顯示:于出生后21天,rd1_Tsc1c KO小鼠視網(wǎng)膜NADPH含量顯著高于對(duì)照組(p0.05)。7.q RT-PCR顯示:與對(duì)照組相比,出生后21天rd1_Tsc1c KO小鼠視網(wǎng)膜中代謝相關(guān)基因Hif-1α,Glut-1,Hk II,G6pd,Pkm2,Me1等均有所增加,并于出生后24天呈現(xiàn)顯著性差異(p0.05)。8.Casp2基因敲除延緩rd1小鼠視錐細(xì)胞死亡。9.于出生后30周,與對(duì)照組Rho-/-小鼠相比Rho-/-,Tsc1c/KO視錐細(xì)胞存留率顯著提高(p0.05);p-S6陽性視錐細(xì)胞數(shù)高于對(duì)照組;代謝相關(guān)基因Hk II,Pkm2等表達(dá)量升高。III.正常小鼠組1.明視ERG結(jié)果顯示與對(duì)照組相比,Raptorc KO小鼠及Rictorc KO小鼠視錐細(xì)胞功能自出生后4個(gè)有所下降后回升,至出生后1年未見顯著異常。Raptorc KO,Rictorc KO小鼠視錐細(xì)胞功能自出生后2個(gè)月至1年持續(xù)顯著下降(p0.05)。2.眼底照相結(jié)果:截止出生后1年,各組小鼠眼底無明顯異常。3.視網(wǎng)膜冰凍切片免疫熒光組織化學(xué)染色結(jié)果:與對(duì)照組相比出生后1年Raptorc KO、Rictorc KO及Raptorc KO,Rictorc KO小鼠①視網(wǎng)膜視錐細(xì)胞特異性蛋白:中波長視蛋白,短波長視蛋白,視錐細(xì)胞視紫紅質(zhì)抑制蛋白,視錐細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的表達(dá)量略有下降,但視錐細(xì)胞數(shù)量無顯著區(qū)別;②腹側(cè)視網(wǎng)膜中波長視蛋白表達(dá)量分別于3至5個(gè)月、4至7個(gè)月、2至3個(gè)月出現(xiàn)一過性減低;③光感受器細(xì)胞外節(jié)部分形態(tài)略顯異常。4.電鏡檢查結(jié)果:半薄切片甲苯胺藍(lán)染色顯示與對(duì)照組相比,m TORC1缺失小鼠及m TORC2缺失小鼠視網(wǎng)膜整體結(jié)構(gòu)并未出現(xiàn)明顯改變。m TORC1缺失小鼠視錐細(xì)胞內(nèi)節(jié)結(jié)構(gòu)較為疏松、變薄;外節(jié)出現(xiàn)退行性改變。高倍電鏡檢查顯示:m TORC1缺失小鼠部分視錐細(xì)胞內(nèi)節(jié)擴(kuò)張,伴或不伴有外節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂,內(nèi)含多個(gè)空泡結(jié)構(gòu)。結(jié)論1.持續(xù)性激活m TORC1活動(dòng)是促進(jìn)視網(wǎng)膜色素變性小鼠視錐細(xì)胞長期存活的必要且充分條件;m TORC2及AKT介導(dǎo)的促細(xì)胞存活調(diào)節(jié)機(jī)制在其中作用并不顯著。2.m TORC1通過促進(jìn)細(xì)胞葡萄糖攝取、蓄積以及增加磷酸戊糖途徑代謝實(shí)現(xiàn)對(duì)視網(wǎng)膜色素變性小鼠視錐細(xì)胞的保護(hù)作用。3.正常小鼠視錐細(xì)胞的正常功能需要m TORC1及m TORC2同時(shí)具有活性。4.正常小鼠視錐細(xì)胞代謝、生長和存活的維持并不依賴于m TORC1和/或m TORC2,提示PI3K對(duì)細(xì)胞的促存活信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制可能并不直接通過其下游的insulin/m TOR通路。
[Abstract]:鐩殑鍏夋劅鍙楀櫒緇嗚優(yōu)鏄漢浣撳唴浠ｈ阿鏈，

本文編號(hào)：1541679