本文關(guān)鍵詞： 耳聾 非綜合征型耳聾 基因檢測(cè) 飛行時(shí)間質(zhì)譜 靶向基因捕獲測(cè)序　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2017年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：耳聾是最常見(jiàn)的出生缺陷性疾病之一,約60%的耳聾與遺傳因素有關(guān)。遺傳性耳聾具有高度的遺傳異質(zhì)性和廣泛的種族差異,我國(guó)耳聾分子流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示,GJB2基因、SLC26A4基因和線粒體基因12SrRNA是我國(guó)耳聾人群主要致病基因,這為在我國(guó)開(kāi)展耳聾基因診斷奠定了基礎(chǔ)。為了滿足我國(guó)臨床對(duì)耳聾基因診斷的需求,本論文建立了一個(gè)從常見(jiàn)耳聾基因突變高通量檢測(cè)到罕見(jiàn)耳聾基因突變高效鑒定的耳聾基因診斷體系。本論文利用自動(dòng)移液工作站和飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)建立了一套包括自動(dòng)化樣本制備和高通量耳聾基因檢測(cè)的中國(guó)人常見(jiàn)耳聾基因高通量檢測(cè)技術(shù)體系,并使用臨床樣本對(duì)該檢測(cè)體系的準(zhǔn)確性及有效性進(jìn)行了評(píng)價(jià);采用靶向基因捕獲和高通量測(cè)序技術(shù)建立了一套可高效鑒定非綜合征型耳聾患者的新致病突變的體系。上述兩個(gè)檢測(cè)體系組成了一個(gè)完整的非綜合征型耳聾基因檢測(cè)的解決方案,對(duì)提高我國(guó)耳聾基因診斷的水平具有較大意義。本論文根據(jù)中國(guó)耳聾分子流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù),選擇了中國(guó)人群常見(jiàn)的3個(gè)耳聾致病基因(GJB2、SLC26A4、線粒體12SrRNA)共30個(gè)突變位點(diǎn),建立了基于飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)技術(shù)的單一反應(yīng)檢測(cè)這30個(gè)突變位點(diǎn)的高通量檢測(cè)方法,利用該方法檢測(cè)了 327例臨床明確基因診斷的非綜合征型耳聾樣本,30個(gè)突變均得到檢出,而且本論文檢測(cè)方法的結(jié)果與臨床基因診斷結(jié)果一致,符合率100%;進(jìn)一步使用該方法檢測(cè)了 373例非綜合征型耳聾患者樣本,發(fā)現(xiàn)210例患者攜帶至少一個(gè)突變(56.30%,210/373),確診患者155例(41.55%,155/373),其中GJB2基因致聾者63例(16.89%,30/373),SLC26A4基因致聾者88例(23.59%,88/373),線粒體基因12SrRNA致聾者4例(1.07%,4/373),并使用基因檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)Sanger測(cè)序法對(duì)分型結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證,兩種方法結(jié)果一致,符合率100%;我們也基于自動(dòng)移液工作站建立了血斑樣本DNA自動(dòng)化制備方法,應(yīng)用該方法和4種磁珠法DNA提取試劑盒提取了 64個(gè)新生兒血斑樣本DNA,DNA平均濃度在10.76 ng/μl至21.88 ng/μl之間,平均純度260/280在1.84至1.99之間,使用飛行時(shí)間質(zhì)譜方法檢測(cè)這64個(gè)樣本,發(fā)現(xiàn)了 5個(gè)耳聾基因突變攜帶者。我們選取了 92例已使用本研究建立的質(zhì)譜檢測(cè)方法未能確診的非綜合征型耳聾樣本,這92例耳聾樣本包括了 90個(gè)先證者樣本及2個(gè)受累同胞樣本,應(yīng)用包括200個(gè)耳聾相關(guān)基因的靶向基因捕獲測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了這92例非綜合征耳聾樣本,對(duì)鑒定到的突變進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,并使用直接測(cè)序法對(duì)鑒定出的突變進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果顯示,有20個(gè)先證者可以確診,診斷率為22.2%,這20個(gè)確診的先證者的38個(gè)致病突變分布在15個(gè)耳聾基因上,其中23個(gè)是新致病突變。本論文基于自動(dòng)移液工作站和飛行時(shí)間質(zhì)譜建立的中國(guó)人常見(jiàn)耳聾基因高通量檢測(cè)技術(shù)體系,具有高通量、高準(zhǔn)確性、低成本等特點(diǎn),可以對(duì)耳聾患者進(jìn)行準(zhǔn)確快速診斷,為規(guī)�；@防控提供了有力的技術(shù)支撐。本論文建立的包含200個(gè)耳聾基因的靶向基因捕獲測(cè)序方法明確了 22.2%的先證者的分子病因,大幅提高了臨床確診率。鑒定了 23個(gè)新致病突變,豐富了中國(guó)人耳聾基因突變數(shù)據(jù)庫(kù),為非綜合征型耳聾分子病因?qū)W研究提供了理論支持。
[Abstract]:Deafness is the most common disease of birth defects, about 60% of the deafness associated with genetic factors. Genetic deafness has high genetic heterogeneity and widespread racial differences in GJB2 gene molecular epidemiological survey data deafness in our country shows that, SLC26A4 gene and mitochondrial gene 12SrRNA in China is the main pathogenic gene for deaf people, which lay the foundation for genetic diagnosis of deafness in China. In order to meet China's demand for clinical genetic diagnosis of deafness, this paper established a mutation from common deafness genes in high-throughput detection to the efficient identification of rare mutations in deafness deafness gene diagnosis system. This paper uses automatic pipetting workstation and time-of-flight mass spectrometry was established common deafness genes in a high-throughput detection automatic sample preparation and high-throughput deafness gene Chinese system detection technology, and the use of clinical samples And the effectiveness of the detection accuracy of the system is evaluated; to capture gene and high-throughput sequencing technology to establish a set of efficient identification of new pathogenic non syndromic deafness mutations in patients with the system target. The two detection system composed of a complete solution of non syndromic deafness gene detection that is of great significance to improve our level of gene diagnosis of deafness. According to the Chinese deafness molecular epidemiological survey data, selected 3 common deafness gene Chinese populations (GJB2, SLC26A4, mitochondrial 12SrRNA) a total of 30 mutations, a time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) detection method based on the 30 mutations in high-throughput detection of single reaction, was detected in 327 cases of clinical definite genetic diagnosis of non syndromic deafness samples by using this method, 30 mutations were detected, and And this paper detection methods and results of clinical gene diagnosis results, the coincidence rate was 100%; the further use of this method to detect 373 cases of non syndromic deafness type samples of patients, 210 patients with at least one mutation (56.30%, 210/373), 155 patients (41.55%, 155/373), including 63 cases of GJB2 gene deaf person (16.89%, 30/373), 88 cases of SLC26A4 gene induced by the deaf (23.59%, 88/373), 4 cases of mitochondrial gene 12SrRNA induced hearing loss (1.07%, 4/373), the gold standard Sanger sequencing method, and gene detection results are verified, the results of the two methods are consistent, the coincidence rate was 100%; we also set up automatic pipetting workstation based on DNA automatic blood spot sample preparation method, the application of this method and 4 kinds of magnetic beads method DNA extraction kit to extract 64 newborn blood spot samples DNA, DNA average concentration between 10.76 ng/ L and 21.88 ng/ L, the average purity of 260/280 Between 1.84 and 1.99, using time-of-flight mass spectrometry method for the detection of the 64 samples, found 5 deafness gene mutation carriers. We selected 92 cases of mass spectrometry has been used in this study failed to establish diagnosis of non syndromic deafness in 92 cases of samples, the sample included 90 probands and sample 2 affected sib sample applications include 200 deafness related gene targeting gene sequencing technique to detect the capture of 92 cases of non syndromic deafness mutations of samples, identified to analyze the bioinformatics, and the mutations identified were verified by direct sequencing. The results showed that there are 20 first card can be diagnosed, the diagnostic rate was 22.2%. 38 of the 20 pathogenic mutations in the proband diagnosed in 15 deafness genes, 23 of which are new mutations. This thesis is based on the automatic pipetting workstation and time-of-flight mass spectrometry Common deafness genes developed high-throughput Chinese detection technology system, with high throughput, high accuracy, low cost, can be rapid and accurate diagnosis of patients with deafness, which provides strong technical support for large-scale deafness prevention. Established in this dissertation contains 200 deafness gene targeting gene sequencing method to capture clear the molecular etiology of 22.2% probands, a substantial increase in the rate of clinical diagnosis. 23 new pathogenic mutations were identified, enriched the gene Chinese deafness mutation database, provides theoretical support for non syndromic deafness molecular etiology of type.

【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R764.43

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本文編號(hào)：1531010