本文關(guān)鍵詞： Smac 小干擾RNA 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 凋亡 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 人晶狀體上皮細(xì)胞　出處：《鄭州大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景白內(nèi)障是世界范圍內(nèi)造成人類致盲的主要眼病。老齡人口的增長(zhǎng)導(dǎo)致患病率也逐年上升。目前白內(nèi)障復(fù)明的主要方法是手術(shù)治療。白內(nèi)障手術(shù)的普及和人工晶狀體不斷地更新和完善給千百萬(wàn)白內(nèi)障患者重新帶來光明,并且國(guó)家每年出資委派醫(yī)療隊(duì)為貧困白內(nèi)障患者免費(fèi)手術(shù)治療,這無疑增加社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。由于我國(guó)人口基數(shù)大,部分偏遠(yuǎn)地區(qū)醫(yī)療條件差以及手術(shù)費(fèi)用昂貴等諸多原因,仍有部分白內(nèi)障患者無法得到有效的手術(shù)治療。因此研究白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)理對(duì)防治和延緩白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在人體內(nèi)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)代謝作用,當(dāng)機(jī)體受到外界刺激,機(jī)體內(nèi)環(huán)境發(fā)生相應(yīng)改變,為對(duì)抗這種刺激便會(huì)誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress,ERS),然而過強(qiáng)的ERS就會(huì)造成細(xì)胞損傷引起凋亡。近幾年有不少學(xué)者研究ERS與年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。我們前期實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Smac高表達(dá)與晶狀體混濁有關(guān),然而缺乏進(jìn)一步研究和探討,本實(shí)驗(yàn)主要分為兩個(gè)方面研究,一方面是探討Smac與年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體混濁是否有關(guān),另一方面是擬下調(diào)Smac表達(dá)后通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞產(chǎn)生的影響。目的1.探討Smac是否與白內(nèi)障發(fā)生有關(guān)。2.研究Smac通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞的影響。方法1.于本院收集人晶狀體前囊膜組織,收集157例(169只眼)年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者的晶狀體前囊膜片及5例正常人(10只眼)捐獻(xiàn)的晶狀體前囊膜。白內(nèi)障患者晶狀體的混濁類型根據(jù)Emery核硬度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn),檢測(cè)Smac在人類晶狀體前囊表達(dá),并采用HE染色和免疫組化半定量法分析Smac和白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。2.選取對(duì)數(shù)期細(xì)胞株,通過RNA干擾技術(shù)使Smac的表達(dá)下調(diào)。用H_2O_2誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,實(shí)驗(yàn)分為四組:PBS組、H_2O_2組、siRNA-NC+H_2O_2組,siRNA-Smac+H_2O_2組。3.轉(zhuǎn)染進(jìn)行24h后采用蛋白印跡法(Western blot)篩選出最佳干擾質(zhì)粒。4.CCK-8法(Cell Counting Kit-8)篩選出合適的H_2O_2濃度誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率接近50%,并檢測(cè)下調(diào)Smac的表達(dá)后對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞活力的影響。5.轉(zhuǎn)染進(jìn)行24-36h后,運(yùn)用Annexin V-APC/PI法檢測(cè)PBS組、H_2O_2組、siRNA-NC+H_2O_2組,siRNA-Smac+H_2O_2組的細(xì)胞凋亡率。6.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription PCR,RT-PCR)檢測(cè)各組GRP78、CHOP、BAX/Bcl-2及caspase-3在m RNA水平的表達(dá)情況。7.Western Blot檢測(cè)GRP78,CHOP,Bax/Bcl-2及cleaved caspase-3檢測(cè)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果1.免疫組化半定量結(jié)果表明,ARC患者的前囊膜中Smac的表達(dá)高于正常人對(duì)照組,輕度和中度白內(nèi)障患者中Smac的表達(dá)與晶狀體混濁沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,重度和全白的白內(nèi)障患者中晶狀體混濁程度越重,Smac表達(dá)的陽(yáng)性率越高。2.篩選出最佳干擾質(zhì)粒為siRNA-Smac3,能夠有效下調(diào)Smac的表達(dá)。3.CCK-8法檢測(cè)出細(xì)胞凋亡率接近50%的H_2O_2的濃度為200μmol/L,作用時(shí)長(zhǎng)為24h,下調(diào)Smac可增加LECs的細(xì)胞活力。4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組凋亡率依次為PBS組(1.7±1.2)%、H_2O_2組(40.1±3.9)%、siRNA-NC+H_2O_2組(45.3±4.4)%,siRNA-Smac+H_2O_2組的凋亡率(26.5±2.8)%,與H_2O_2組相比,Smac的下調(diào)能夠使凋亡率下降(P0.05)5.RT-PCR檢測(cè)出siRNA-Smac+H_2O_2組比較H_2O_2組中的GRP78、CHOP、caspase-3及BAXm RNA表達(dá)減弱,Bcl-2在m RNA水平表達(dá)上調(diào)。6.Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞結(jié)果顯示Smac下調(diào)后GRP78、CHOP、cleaved caspase-3、Bax蛋白水平的表達(dá)下降,Bcl-2相應(yīng)增多。結(jié)論Smac與年齡相關(guān)性白內(nèi)障密切相關(guān),下調(diào)Smac的表達(dá)能夠抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑阻止人晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R776.1

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本文編號(hào)：1520958