本文關(guān)鍵詞： 神經(jīng)血管單元 缺血性視網(wǎng)膜病變 神經(jīng)元 內(nèi)皮祖細(xì)胞 小膠質(zhì)細(xì)胞　出處：《吉林大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：缺血性視網(wǎng)膜病變中,由于視網(wǎng)膜缺血缺氧,既可誘發(fā)視網(wǎng)膜新生血管的形成,又可導(dǎo)致谷氨酸大量釋放,促使神經(jīng)元細(xì)胞死亡。在缺血性疾病中,“神經(jīng)血管單元”的概念強(qiáng)調(diào)神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在疾病的神經(jīng)與血管修復(fù)過程中均起到至關(guān)重要的作用。內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞,具有高度增殖的潛力及血管內(nèi)皮的特性,能夠聚集到不同的缺血組織中促進(jìn)血管內(nèi)皮的修復(fù),具有保護(hù)血管內(nèi)皮功能的重要作用。小膠質(zhì)細(xì)胞在不同的條件下呈現(xiàn)不同的活化狀態(tài),經(jīng)不同刺激因素活化后可表現(xiàn)為促炎型M1和抗炎型M2。缺血性視網(wǎng)膜病變中神經(jīng)細(xì)胞的凋亡增多,小膠質(zhì)細(xì)胞通過在低氧條件下使神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)和釋放細(xì)胞因子參與視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞死亡調(diào)控�；诖�,本研究將EPCs注射到氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變小鼠模型的玻璃體腔內(nèi),觀察其對(duì)視網(wǎng)膜血管的作用,并體外培養(yǎng)小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元并使用海人藻酸(KA)(谷氨酸結(jié)構(gòu)類似物)誘導(dǎo)建立興奮毒性神經(jīng)元損傷的體外模型,與不同激活狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng),觀察小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)損傷后的神經(jīng)元的作用,為缺血性視網(wǎng)膜病變的細(xì)胞治療及免疫治療提供新的思路。目的:探討缺血性視網(wǎng)膜病變中玻璃體腔移植的EPCs對(duì)小鼠氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變(OIR)視網(wǎng)膜血管損傷的治療作用及激活的不同亞型小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)KA介導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)元興奮毒性損傷的免疫調(diào)控機(jī)制。方法:(1)用60%Percoll分離液密度梯度離心的方法分離人臍帶血中EPCs,用5μmol/L羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(CFSE)標(biāo)記EPCs。應(yīng)用混合氣體(75%氧氣:25%氮?dú)?制作C57BL/6J小鼠OIR模型。實(shí)驗(yàn)分組:正常對(duì)照組(NC組)24眼、高氧組(OIR組)48眼、EPCs組30眼和磷酸鹽緩沖液組(PBS組)18眼,其中EPCs組和PBS組分別與OIR小鼠玻璃體腔內(nèi)注射CFSE標(biāo)記EPCs或PBS。分時(shí)段處死各組小鼠,行視網(wǎng)膜石蠟切片、冰凍切片、視網(wǎng)膜鋪片ADP酶染色、伊文思藍(lán)心腔灌注視網(wǎng)膜鋪片等檢查,比較EPCs移植前后視網(wǎng)膜新生血管消退情況及示蹤EPCs。(2)取胚胎16-18天(d)胎鼠視網(wǎng)膜行視網(wǎng)膜混合神經(jīng)元原代培養(yǎng),并應(yīng)用KA誘導(dǎo)建立視網(wǎng)膜神經(jīng)元毒性損傷模型,CCK8檢測評(píng)估視網(wǎng)膜神經(jīng)元活性的損傷程度。取生后0-2d(P0-2)新生小鼠大腦皮質(zhì)行混合膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng),利用免疫磁珠技術(shù)分選出小膠質(zhì)細(xì)胞,并加入不同組合的細(xì)胞因子使其誘導(dǎo)分化為激活狀態(tài),ELISA法測定M0/M1/M2分泌的各種細(xì)胞因子濃度。建立視網(wǎng)膜神經(jīng)元與各亞型小膠質(zhì)細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型,通過CCK8檢測評(píng)估共培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)元活性的影響及損傷程度,并加入KA刺激,通過CCK8檢測評(píng)估不同亞型小膠質(zhì)細(xì)胞M0/M1/M2與視網(wǎng)膜神經(jīng)元共培養(yǎng)對(duì)KA致神經(jīng)元毒性損傷的影響,并通過ELISA測定不同共培養(yǎng)組別分泌細(xì)胞因子的濃度變化。結(jié)果:(1)通過視網(wǎng)膜鋪片ADP酶染色觀察,OIR組和PBS組小鼠視網(wǎng)膜血管擴(kuò)張、迂曲,甚至閉塞并形成無灌注區(qū),出現(xiàn)部分新生血管叢。EPCs組在注射后1周(w)視網(wǎng)膜缺氧表現(xiàn)較同時(shí)間段PBS組及OIR組有所減輕,顯示較少的無灌注區(qū)域和新生血管簇。(2)在P19,組織病理學(xué)觀察NC組視網(wǎng)膜內(nèi)叢狀層和內(nèi)界膜之間的細(xì)胞均為神經(jīng)節(jié)細(xì)胞,呈單層分布,其細(xì)胞核呈圓形且大。OIR組和PBS組視網(wǎng)膜可見內(nèi)叢狀層和內(nèi)界膜之間的細(xì)胞數(shù)量顯著增加,其中大部分是非神經(jīng)節(jié)細(xì)胞,細(xì)胞核呈現(xiàn)各種形態(tài),有一些新生血管細(xì)胞核,且這些細(xì)胞的分布是完全無序的,許多新生血管細(xì)胞核突破內(nèi)界膜。EPCs組視網(wǎng)膜非神經(jīng)節(jié)細(xì)胞較少,罕有突破內(nèi)界膜的新生血管細(xì)胞核,內(nèi)叢狀層與內(nèi)界膜之間視網(wǎng)膜細(xì)胞呈現(xiàn)相對(duì)整齊的排列,突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)量較PBS組明顯減少(P0.05,n=6)。(3)移植后視網(wǎng)膜冰凍切片顯示,CFSE標(biāo)記EPCs移植后3d可見玻璃體大量熒光細(xì)胞,1w可見EPCs存在于內(nèi)叢狀層和內(nèi)界膜之間。伊文思藍(lán)視網(wǎng)膜鋪片法觀察EPCs組在注射后3d可見大量CFSE標(biāo)記的EPCs位于玻璃體及粘附于視網(wǎng)膜表面,1w可見EPCs出現(xiàn)在視網(wǎng)膜血管中。(4)KA可對(duì)原代培養(yǎng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)元造成興奮性毒性損傷,部分視網(wǎng)膜神經(jīng)元出現(xiàn)軸突斷裂、損傷甚至死亡,神經(jīng)元活性CCK8檢測結(jié)果為54.6%±2.0%。以LPS和IFNγ聯(lián)合刺激可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞向M1型分化,可分泌TNF-α、IFN-γ和IL-6。IL-4、IL-10和TGF-β聯(lián)合刺激可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型分化,可分泌IL-4和IL-10。(5)建立視網(wǎng)膜神經(jīng)元與分化后的小膠質(zhì)細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型。M1與視網(wǎng)膜神經(jīng)元共培養(yǎng)使部分視網(wǎng)膜神經(jīng)元死亡、軸突斷裂,神經(jīng)元活性僅為40.52%±4.84%;而與M2型小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的神經(jīng)元活性無明顯影響,為99.12%±0.86%。兩組間比較有顯著性差異(P0.01,n=3)。與M1共培養(yǎng)的神經(jīng)元在加入KA刺激后神經(jīng)元損傷加重,活性為21.48%±1.70%;而與M2型小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的神經(jīng)元在加入KA刺激后僅有輕度軸突損傷、少許細(xì)胞死亡,活性為90.26%±4.19%。兩組間比較有顯著性差異(P0.01,n=3)。(6)KA刺激或未刺激情況下,與M1共培養(yǎng)的神經(jīng)元相比,M0共培養(yǎng)的神經(jīng)元和M2共培養(yǎng)的神經(jīng)元分泌IL-6顯著減少(P0.05,n=3);加入KA與不加入KA比較,M0共培養(yǎng)的神經(jīng)元和M1共培養(yǎng)的神經(jīng)元分泌IL-6明顯增加(分別為P0.001,n=3;P0.05,n=3)。加入KA或不加入KA的情況下,神經(jīng)元分泌IL-10無明顯變化(P0.05,n=3);在不加入KA的共培養(yǎng)模型中,與單純培養(yǎng)神經(jīng)元相比,M1共培養(yǎng)的神經(jīng)元分泌IL-10顯著減少(P0.001,n=3);加入KA的共培養(yǎng)模型中,與單純培養(yǎng)神經(jīng)元或M0共培養(yǎng)的神經(jīng)元相比,M1共培養(yǎng)的神經(jīng)元和M2共培養(yǎng)的神經(jīng)元分泌IL-10濃度均顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:(1)人臍血分離出的EPCs經(jīng)玻璃體腔注射移植到OIR小鼠體內(nèi)可對(duì)OIR病變的回退起到一定的促進(jìn)作用。(2)誘導(dǎo)分化后的M2型小膠質(zhì)細(xì)胞可在體外保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)元免受KA介導(dǎo)的神經(jīng)興奮毒性作用。(3)缺血性視網(wǎng)膜病變中的“神經(jīng)血管單元”,即內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,在血管修復(fù)和神經(jīng)修復(fù)中起重要作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R774.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1515017