本文關鍵詞： 真菌性角膜炎 中性粒細胞 凋亡 小鼠　出處：《青島大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的:探究凝集素樣氧化性低密度脂蛋白受體-1(lectin-like oxidized low density lipoprotein recepter-1,LOX-1)調(diào)控真菌性角膜炎中性粒細胞凋亡機制。方法:該實驗分別在真菌性角膜炎小鼠體內(nèi)動物模型和培養(yǎng)的小鼠腹腔提取中性粒細胞真菌刺激的體外細胞模型上研究調(diào)控真菌性角膜炎中性粒細胞凋亡機制。隨機將健康的C57BL/6小鼠隨機分為對照組和煙曲霉菌感染組,分別于0、1天、3天、5天觀察小鼠角膜感染情況后處死小鼠,收集小鼠的角膜,采用qRT-PCR技術檢測小鼠角膜中促進凋亡的基因Fas、FasL,Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9mRNA和抑制凋亡的基因Bc L-2mRNA的表達情況,免疫熒光技術檢測角膜中中性粒細胞的浸潤和活化的Caspase-3蛋白的表達情況以及TUNEL技術檢測角膜中細胞的凋亡情況。用LOX-1的中和抗體和IgG或LOX-1的抑制劑Poly I和PBS預處理,然后用煙曲霉菌菌絲去感染小鼠的角膜,分別在0、0.5天、1天、3天、5天觀察小鼠角膜的感染情況后處死小鼠,收集小鼠的角膜,檢測阻斷和抑制LOX-1后小鼠角膜中促進凋亡的基因Fas、FasL,Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9mRNA和抑制凋亡的基因BcL-2mRNA的表達情況,角膜中浸潤中性粒細胞的染色和活化的Caspase-3蛋白的表達情況以及角膜中凋亡細胞的染色。從C57BL/6小鼠腹腔中提取分離中性粒細胞,煙曲霉菌菌絲刺激中性粒細胞0、4h、8h、12h、16h后觀察細胞情況并收集細胞,采用qRT-PCR技術檢測小鼠角膜中促進凋亡的基因Fas、FasL、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9m RNA和抑制凋亡的基因BcL-2m RNA的表達情況。從C57BL/6小鼠腹腔中提取分離中性粒細胞,用LOX-1的中和抗體和IgG或LOX-1的抑制劑Poly I和PBS預處理,煙曲霉菌菌絲刺激腹腔提取分離中性粒細胞8h,,運用qRT-PCR技術檢測阻斷和抑制LOX-1后中性粒細胞中促進凋亡的基因Fas、FasL、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9m RNA和抑制凋亡的基因BCL-2mRNA的表達情況,采用蛋白質(zhì)印跡和流式細胞術檢測中性粒細胞中活化的Caspase-3蛋白的表達情況以及中性粒細胞的凋亡情況。結果:感染C57BL/6小鼠角膜與正常角膜相比,促進凋亡的基因Fas、FasL、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9mRNA的表達,浸潤中性粒細胞數(shù)目,活化的caspase3蛋白和TUNEL-陽性細胞數(shù)目均顯著增高,相反,凋亡抑制的基因BCL2mRNA的水平顯著降低。采用LOX-1中和抗體和抑制劑Ploy I處理后,對比IgG或PBS對照組,C57BL/6小鼠角膜組織中Fas、FasL、Caspase-3、Caspase-8、和Caspase-9mRNA,浸潤中性粒細胞數(shù)目,活化的caspase3蛋白質(zhì)和TUNEL-陽性細胞的顯著降低但BCL2mRNA水平升高。在小鼠腹腔提取分離中性粒細胞中,對比單純未刺激組,煙曲霉菌菌絲刺激后促進凋亡的基因Fas、FasL、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9mRNA、和促進凋亡BCL-2mRNA的表達均增高,而且8h煙曲霉菌菌絲刺激后凋亡基因增高最顯著。與中性粒細胞中的IgG或PBS處理后的對照組相比,用中和抗體或抑制劑PloyI處理后,Fas、FasL、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9mRNA的表達明顯降低而BCL2mRNA表達增多,活化的caspase3蛋白,和凋亡的中性粒細胞顯著減少。結論:在煙曲霉菌感染小鼠角膜或刺激小鼠腹腔提取分離中性粒細胞后中性粒細胞的凋亡增高,而抑制LOX-1可以減少煙曲霉菌感染的小鼠角膜中性粒細胞的促凋亡的基因和抗凋亡基因,半胱天冬酶-3激活和中性粒細胞細胞凋亡。說明LOX-1抑制是通過減少Fas和Fas配體的結合,增加BCL-2的表達以及抑制炎癥中半胱氨酸蛋白酶級聯(lián)的活化,從而抑制胞內(nèi)信號級聯(lián)并減少中性粒細胞凋亡。
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【學位授予單位】：青島大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R772.21

【參考文獻】

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本文編號：1505263