發(fā)布時間：2018-02-03 09:01

  本文關(guān)鍵詞： FoxM1 喉癌 硫鏈絲菌肽 RNA干擾 抑制劑　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：1、研究在體外環(huán)境下抑制劑硫鏈絲菌肽下調(diào)FoxM1表達(dá)后對喉癌Hep-2細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移、克隆形成能力的影響及其中的分子機(jī)制。2、研究在體內(nèi)環(huán)境下抑制劑硫鏈絲菌肽下調(diào)FoxM1表達(dá)后對喉癌Hep-2細(xì)胞體內(nèi)生長的影響及分子機(jī)制。3、研究通過RNA干擾下調(diào)FoxM1表達(dá)后對喉癌Hep-2細(xì)胞體外克隆形成能力,以及在體內(nèi)生長的影響。方法：1、運用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法和免疫印跡(western blot)法檢測硫鏈絲茵肽對Hep-2細(xì)胞中FoxMl表達(dá)的影響。2、運用CCK-8法檢測硫鏈絲菌肽下調(diào)FoxMl后對Hep-2細(xì)胞細(xì)胞活力的影響。3、運用CFSE作為探針染色Hep-2細(xì)胞,通過流式細(xì)胞儀檢測硫鏈絲菌肽下調(diào)FoxM1對Hep-2細(xì)胞增殖的影響。通過流式細(xì)胞儀檢測硫鏈絲菌肽下調(diào)FoxM1對Hep-2細(xì)胞細(xì)胞周期的影響。運用RT-PCR法和western blot法檢測硫鏈絲菌肽下調(diào)FoxM1后對細(xì)胞周期蛋白cyclinD1和cyclinE1的表達(dá)水平的影響。4、運用Annexin V-FITC/PI雙染法和流式細(xì)胞儀檢測硫鏈絲菌肽下調(diào)FoxM1對Hep-2細(xì)胞凋亡的影響。運用Tunel法進(jìn)一步驗證硫鏈絲菌肽下調(diào)FoxM1對Hep-2細(xì)胞凋亡的影響。運用RT-PCR法和western blot法檢測硫鏈絲菌肽下調(diào)FoxM1后對Bcl-2、Bax、p53的mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響。運用JC-1作為探針染料,流式細(xì)胞儀檢測硫鏈絲菌肽下調(diào)FoxM1對Hep-2細(xì)胞線粒體膜電位的影響。運用western blot法檢測鏈絲菌肽下調(diào)FoxM1對Hep-2細(xì)胞中細(xì)胞色素C、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3和cleaved PARP的蛋白表達(dá)水平的影響。通過Annexin V-FITC/PI雙染法和流式細(xì)胞儀檢測經(jīng)caspase抑制劑z-VAD-fmk預(yù)處理后的硫鏈絲菌肽對Hep-2細(xì)胞凋亡的影響,以及通過western blot法檢測其中cleaved caspase-3的表達(dá)變化。運用 western blot法檢測鏈絲菌肽下調(diào)FoxM1對Hep-2細(xì)胞中的FADD、cleaved caspase-8、cIAP1、XIAP和survivin蛋白表達(dá)水平的影響。5、運用侵襲實驗和遷移實驗檢測硫鏈絲菌肽下調(diào)FoxM1對Hep-2細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響。運用RT-PCR法和ELISA法檢測硫鏈絲菌肽下調(diào)FoxM1對Hep-2細(xì)胞中MMP-2、MMP-9的mRNA表達(dá)水平,以及Hep-2細(xì)胞上清液中MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平的影響。6、運用軟瓊脂克隆形成實驗檢測硫鏈絲菌肽下調(diào)FoxM1對Hep-2細(xì)胞克隆形成能力的影響。7、構(gòu)建裸鼠移植瘤模型觀察硫鏈絲菌肽下調(diào)FoxM1對Hep-2細(xì)胞在體內(nèi)生長的影響。通過western blot法和免疫組織化學(xué)法檢測硫鏈絲菌肽作用后對裸鼠腫瘤組織中FoxM1、Ki67和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平的影響。8、通過慢病毒侵染Hep-2細(xì)胞,構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FoxM1shRNA Hep-2細(xì)胞株。運用軟瓊脂克隆形成實驗檢測RNA干擾下調(diào)FoxM1對Hep-2細(xì)胞克隆形成能力的影響。運用裸鼠移植瘤模型觀察RNA干擾下調(diào)FoxM1對Hep-2細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)腫瘤生長的影響。結(jié)果：1、經(jīng)硫鏈絲菌肽作用后Hep-2細(xì)胞中FoxM1的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低。2、硫鏈絲菌肽通過下調(diào)FoxM1表達(dá)抑制了Hep-2細(xì)胞細(xì)胞活力。3、硫鏈絲菌肽通過下調(diào)FoxM1表達(dá)抑制了Hep-2細(xì)胞分裂增殖,將細(xì)胞周期阻滯于S期,同時導(dǎo)致了細(xì)胞周期蛋白cyclinD1和cyclinE1的表達(dá)下調(diào)。4、硫鏈絲菌肽通過下調(diào)FoxM1促進(jìn)了Hep-2細(xì)胞凋亡。硫鏈絲菌肽還下調(diào)Bcl-2表達(dá),上調(diào)Bax、p53表達(dá),促使線粒體膜電位下降,引起細(xì)胞色素C從線粒體中釋放到細(xì)胞胞漿中,激活cleaved caspase 9、 cleaved caspase-3和cleaved PARP,說明線粒體-caspase通路參與其中。其次,硫鏈絲菌肽下調(diào)FoxMl還導(dǎo)致Hep-2細(xì)胞中FADD和cleaved caspase-8的蛋白表達(dá)水平增加,說明Fas信號通路參與其中。此外,硫鏈絲菌肽下調(diào)FoxMl還導(dǎo)致IAP蛋白家族中cIAP1、 XIAP和survivin表達(dá)水平降低,說明IAP蛋白家族也參與了該凋亡過程。5、硫鏈絲菌肽下調(diào)FoxM1抑制了Hep-2侵襲和遷移能力,并導(dǎo)致侵襲、轉(zhuǎn)移因子MMP-2和MMP-9的表達(dá)下調(diào)。6、硫鏈絲菌肽下調(diào)FoxM1抑制了Hep-2細(xì)胞克隆形成能力。7、硫鏈絲菌肽下調(diào)FoxM1表達(dá)抑制了Hep-2細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤能力,并發(fā)現(xiàn)硫鏈絲茵肽作用后引起腫瘤組織中Ki67蛋白表達(dá)水平下降,cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平增加。8、成功構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FoxM1shRNA Hep-2細(xì)胞株。RNA干擾下調(diào)FoxM1表達(dá)抑制了Hep-2細(xì)胞體外克隆形成能力,并抑制了Hep-2細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)生長能力。結(jié)論：1、硫鏈絲菌肽下調(diào)FoxM1抑制了喉癌細(xì)胞增殖,其機(jī)制可能通過阻滯細(xì)胞于S期,以及抑制細(xì)胞周期蛋白如cyclinD1和cyclinE1的表達(dá)。2、硫鏈絲菌肽下調(diào)FoxM1促進(jìn)了喉癌細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能通過線粒體-caspase通路、Fas信號通路以及作用于IAP蛋白家族。3、硫鏈絲菌肽下調(diào)FoxM1抑制了喉癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移以及克隆形成能力,機(jī)制可能通過下調(diào)MMP-2和MMP-9表達(dá)。4、硫鏈絲菌肽下調(diào)FoxM1抑制了喉癌細(xì)胞在體內(nèi)的生長,其機(jī)制可能通過抑制細(xì)胞的增殖和促進(jìn)其凋亡實現(xiàn)。5、RNA干擾下調(diào)FoxM1可抑制喉癌細(xì)胞體外克隆形成能力以及體內(nèi)生長能力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R739.65

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本文編號：1486964