本文關(guān)鍵詞： 氧化應(yīng)激 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞 慢性高眼壓 超氧化物歧化酶 過氧化氫酶 視神經(jīng)萎縮蛋白1 發(fā)動相關(guān)蛋白-1　出處：《中南大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的： 觀察慢性高眼壓狀態(tài)下,視網(wǎng)膜內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)的改變對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cell,RGC)損傷的程度,以及此狀態(tài)下線粒體形態(tài)和功能蛋白的變化；以重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的錳超氧化物歧化酶(Manganese superoxide dismutase, MnSOD)基因轉(zhuǎn)染大鼠視網(wǎng)膜并建立慢性高眼壓模型,探討其對高眼壓環(huán)境下的RGC的保護(hù)作用機(jī)制。 方法： 1.以聯(lián)合光凝SD大鼠左眼的小梁網(wǎng)和上、下、顳側(cè)鞏膜淺表靜脈,建立慢性高眼壓模型,根據(jù)觀察時間將高眼壓大鼠(高眼壓組)隨機(jī)分為G1組、G2組、G3組、G6組,以右眼為自身對照眼(正常對照組)；觀察光凝后1月、2月、3月、6月大鼠組織病理改變,末端脫氧核酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧三磷酸尿苷缺口末端標(biāo)記法(terminal TdT-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)法檢測RGC凋亡情況,Brn3b抗體免疫熒光化學(xué)法特異性標(biāo)記進(jìn)行RGC并計(jì)數(shù),觀察高眼壓狀態(tài)下RGC存活情況； 2.檢測視網(wǎng)膜組織勻漿中MnSOD、過氧化氫酶(catalase,CAT)活性及丙二醛(malondialdehyde bisdimethyl acetal,MDA)含量,Realtime-PCR法檢測MnSOD、CATmRNA表達(dá)情況；Realtime-PCR. Western Blot法檢測視網(wǎng)膜組織中Caspase-3mRNA及蛋白表達(dá)情況； 3.大鼠左眼玻璃體腔內(nèi)注射PTR-UF11-MnSOD質(zhì)粒,對視網(wǎng)膜行MnSOD基因轉(zhuǎn)染,右眼注射空載質(zhì)粒,21天后行左眼聯(lián)合光凝建立慢性高眼壓模型,根據(jù)觀察時相將轉(zhuǎn)染組分為IG1、IG2、IG3、IG6組,右眼為自身對照眼；運(yùn)用Western Blot法對各轉(zhuǎn)染組視網(wǎng)膜內(nèi)MnSOD蛋白含量進(jìn)行檢測,以確定轉(zhuǎn)染成功；觀察造模后1月、2月、3月、6月轉(zhuǎn)染組大鼠視網(wǎng)膜病理形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)改變,檢測MDA含量,TUNEL法檢測RGC凋亡情況,Brn3b抗體免疫熒光化學(xué)法進(jìn)行視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)；Realtime-PCR及Western Blot法檢測方法檢測治療組視網(wǎng)膜中Caspase-3表達(dá)情況； 4.提取視網(wǎng)膜線粒體,并用Western Blot法檢測高眼壓組和轉(zhuǎn)染組大鼠視網(wǎng)膜線粒體內(nèi)視神經(jīng)萎縮蛋白1(OPA1)、發(fā)動相關(guān)蛋白1(Drp-1)蛋白含量變化,Realtime-PCR檢測高眼壓組和轉(zhuǎn)染組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)OPA1、Drp-1mRNA含量。 結(jié)果： 1.慢性高眼壓模型組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層形態(tài)隨造模月齡增加而逐漸變薄、空泡變性及核固縮增加,電鏡觀察線粒體腫脹、水腫、溶解,視神經(jīng)纖維排列紊亂度增加,與間質(zhì)組織分界欠清；Brn3b特異性標(biāo)記RGC存活數(shù)目隨觀察月齡逐漸減少；隨觀察時相延長,TUNEL法檢測視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯上升； 2.與正常對照組比較,高眼壓組大鼠視網(wǎng)膜組織中MnSOD、CAT活性隨觀察時間延長均有下降趨勢(p0.01),但其mRNA表達(dá)上調(diào)(p0.05)；高眼壓組視網(wǎng)膜內(nèi)丙二醛含量隨觀察時相延長而增加(p0.01)；高眼壓組視網(wǎng)膜組織內(nèi)caspase-3含量隨觀察時相延長而上調(diào)(p0.05)；眼壓恢復(fù)正常后,即觀察時間6月,與正常組比較,RGC存活數(shù)仍在下降(p0.05), TUNEL法檢測視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡陽性率仍在上升(p0.05), MnSOD、CAT活性仍在下降(p0.01),凋亡相關(guān)因子caspase-3表達(dá)仍下調(diào)(p0.05);隨觀察時相的延長,青光眼組大鼠視網(wǎng)膜線粒體內(nèi)OPA1蛋白含量降低,而線粒體內(nèi)Drp-1蛋白含量升高；視網(wǎng)膜內(nèi)OPA1基因表達(dá)下調(diào),Drp-1基因表達(dá)上調(diào)(p0.05)； 3.相同觀察時相,轉(zhuǎn)染組視網(wǎng)膜病理結(jié)構(gòu)改變較高眼壓眼組輕微,Brn-3b特異性標(biāo)記RGC存活率明顯上升,TUNEL法檢測視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡數(shù)明顯降低；轉(zhuǎn)染組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)Caspase-3含量較正常組增加(p0.05),但較高眼壓組明顯降低；MnSOD基因轉(zhuǎn)染后,視網(wǎng)膜內(nèi)OPA1含量總體趨勢上調(diào),Drp-1含量總體趨勢為下調(diào),表明MnSOD促進(jìn)線粒體的融合狀態(tài),而使線粒體分裂減少。但觀察時相為6月時,OPA1無論是線粒體內(nèi)蛋白含量,還是總體基因表達(dá)量,均有輕度降低。 結(jié)論： 1.成功建立慢性高眼壓大鼠模型,并改進(jìn)光凝間隔時間,觀察并證實(shí)此種模型高眼壓狀態(tài)持續(xù)時間達(dá)到12周； 2.慢性高眼壓狀態(tài)下；視網(wǎng)膜內(nèi)抗氧化防御體系功能降低；眼壓恢復(fù)正常后,視網(wǎng)膜損傷仍在繼續(xù)。 3.慢性高眼壓狀態(tài)下,抗氧化物酶SOD、CAT活性降低,但兩者基因表達(dá)量升高,推測在氧化應(yīng)激狀態(tài)下,SOD、CAT蛋白翻譯過程受阻； 4.從OPA1和Drp-1線粒體內(nèi)蛋白含量和其視網(wǎng)膜內(nèi)基因表達(dá)變化推測,氧化應(yīng)激狀態(tài)使OPA1從線粒體釋放,而Drp-1由胞漿轉(zhuǎn)入線粒體,從而使線粒體分裂增加,融合減少,細(xì)胞凋亡增加； 5.視網(wǎng)膜內(nèi)MnSOD含量增加對于高眼壓持續(xù)狀態(tài)的RGC起到保護(hù)性作用,細(xì)胞凋亡減少；且MnSOD促進(jìn)線粒體的融合狀態(tài),而使線粒體分裂減少。但其并不能完全消除氧化應(yīng)激的損傷。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R775

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本文編號：1472889