本文關(guān)鍵詞： 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤 SHH基因 細(xì)胞增殖 細(xì)胞凋亡 PI3K/Akt信號通路　出處：《吉林大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：視神經(jīng)母細(xì)胞瘤(Retinoblastoma,RB)是嬰幼兒中較為常見的一種起源于視網(wǎng)膜胚胎性的眼內(nèi)惡性腫瘤,發(fā)病率約為1:15000,近年來仍有逐漸上升的趨勢。RB多發(fā)于嬰幼兒,若不給予及時治療,RB易在眼球內(nèi)迅速生長和擴(kuò)散,最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜分離和壞死,并沿視神經(jīng)向顱內(nèi)蔓延,嚴(yán)重危害患兒的視力和生命。目前RB的主要治療方法有光凝、手術(shù)、冷凍以及放化療等,但這些方法均存在諸多副作用。深入探討RB的病理機(jī)制,尋求更好、更有效的治療方案對RB的臨床防治具有重要意義。SHH基因是Hedgehog(HH)的三個同源基因之一,在胚胎發(fā)育形成、細(xì)胞生長分化過程中具有重要調(diào)控功能。既往研究表明在髓母細(xì)胞瘤、基底細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、肺癌中均存在HH的異常表達(dá),SHH被認(rèn)為是腫瘤惡性程度高的標(biāo)志物之一。HH通路的異�；罨苯訁⑴c腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程,靶向調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期及侵襲相關(guān)蛋白因子Cyclin D、Cyclin E、N-Myc等的表達(dá),進(jìn)而影響細(xì)胞周期、分化及凋亡等生理過程。研究顯示RB臨床組織樣本中SHH基因顯著高表達(dá),且SHH基因表達(dá)水平與RB腫瘤分期、局部浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。但SHH在RB中的具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚,SHH對RB細(xì)胞生物學(xué)功能的影響有待進(jìn)一步深入研究。PI3K/Akt信號通路在多種腫瘤中持續(xù)性激活,研究表明該通路的激活能夠誘導(dǎo)細(xì)胞周期相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄,破壞促凋亡(Bax、Bad)和抗凋亡(Bcl-2)蛋白表達(dá)的平衡,抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖。此外,在胰腺癌中的研究顯示,HH信號通路失活后通過抑制PI3K/Akt信號通路減少細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中外源性加入SHH能提高Hedgehog信號通路的活性,增加p-Akt的表達(dá),阻斷Hedgehog通路后p-Akt表達(dá)顯著下降;PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294002能夠減少SHH誘導(dǎo)的MMP2、MMP9的異常表達(dá),降低細(xì)胞的侵襲和遷移能力,表明HH信號通路可以通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路活性介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖和生長。但視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中HH是否通過PI3K/Akt信號通路影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)活性尚不清楚。本研究通過RNA干擾技術(shù)沉默視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤WERI-Rb-1細(xì)胞中SHH的表達(dá),觀察SHH基因沉默對RB細(xì)胞增殖凋亡的影響,并深入探討SHH對PI3K/Akt信號通路的調(diào)控作用,明確SHH基因在RB發(fā)生進(jìn)展中的作用和分子機(jī)制,旨在為以SHH為靶點的RB分子靶向治療提供理論依據(jù)。1.RNA干擾SHH基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建和篩選目的:構(gòu)建特異性針對SHH基因的RNA干擾質(zhì)粒SHH-sh RNA,并驗證該重組質(zhì)粒對RB細(xì)胞WERI-Rb-1中SHH在m RNA水平和蛋白水平的抑制效果,為研究SHH對WERI-Rb-1細(xì)胞生物學(xué)功能的影響提供理論基礎(chǔ)。方法:設(shè)計3條針對SHH的干擾序列及1條陰性對照序列,酶切后與sh RNA表達(dá)質(zhì)粒p RNAH1.1連接,構(gòu)建針對SHH的RNA干擾重組質(zhì)粒及其陰性對照質(zhì)粒。將SHH-sh RNA重組質(zhì)粒及陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染W(wǎng)ERI-Rb-1細(xì)胞,并通過G418篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞。Real-time PCR檢測細(xì)胞中SHH m RNA表達(dá)水平,篩選沉默效果最佳的干擾序列,Western blot檢測各組細(xì)胞中SHH蛋白表達(dá)水平,在蛋白水平上驗證SHH-sh RNA的抑制效果。結(jié)果:成功構(gòu)建了針對SHH的特異性RNA干擾質(zhì)粒SHH-sh RNA-1、SHH-sh RNA-2、SHH-sh RNA-3及陰性對照NC,轉(zhuǎn)染W(wǎng)ERI-Rb-1后G418篩選得到穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞,Real-time PCR檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,SHH-sh RNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中SHH m RNA表達(dá)水平均下降,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。與SHH-sh RNA-2(35%)、SHH-sh RNA-3(68%)組相比,SHH-sh RNA-1的沉默效果最佳,干擾效率達(dá)到82%。因此選擇SHH-sh RNA-1轉(zhuǎn)染的WERI-Rb-1細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗,Western blot檢測WERI-Rb-1組、NC組和SHH-sh RNA組細(xì)胞中SHH蛋白表達(dá)水平,結(jié)果顯示SHH-sh RNA組細(xì)胞中SHH蛋白表達(dá)水平顯著下降,干擾效率達(dá)到75%,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。結(jié)論:成功構(gòu)建特異性針對SHH基因的RNA干擾質(zhì)粒SHH-sh RNA,轉(zhuǎn)染W(wǎng)ERI-Rb-1細(xì)胞后能有效抑制SHH在m RNA和蛋白水平的表達(dá),為SHH在WERI-Rb-1細(xì)胞增殖和凋亡中的作用研究提供了基礎(chǔ)。2.SHH基因干擾對視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響目的:明確SHH基因沉默對視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤WERI-Rb-1細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法:實驗設(shè)置WERI-Rb-1組、NC組和SHH-sh RNA組,通過MTT實驗檢測SHH基因沉默對WERI-Rb-1細(xì)胞增殖的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞周期的變化,克隆形成實驗檢測各組細(xì)胞體外成瘤能力;流式細(xì)胞術(shù)Annexin V/PI雙染和Hoechst染色檢測SHH沉默對細(xì)胞凋亡的影響;Western blot檢測SHH基因沉默后細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase-3、Cleaved-PARP、Bcl-2、Bax的表達(dá)。結(jié)果:MTT檢測結(jié)果顯示SHH-sh RNA組與對照組相比,細(xì)胞增殖能力顯著下降(P0.01);流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期結(jié)果顯示SHH基因沉默后G0/G1期細(xì)胞比例增加,S期和G2/M期細(xì)胞比例下降,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),細(xì)胞克隆形成實驗結(jié)果顯示SHH-sh RNA組細(xì)胞克隆形成數(shù)顯著減少(P0.01);流式細(xì)胞術(shù)Annexin V/PI雙染和Hoechst染色結(jié)果均表明SHH-sh RNA組細(xì)胞凋亡率增加(P0.01)。Western blot檢測結(jié)果顯示SHH-sh RNA組細(xì)胞中Cleaved caspase-3、Cleaved-PARP、Bax蛋白表達(dá)水平顯著增加,Bcl-2含量下降(P0.05)。結(jié)論:SHH基因沉默能抑制WERI-Rb-1細(xì)胞增殖,使細(xì)胞周期停滯于G0/G1期,并通過下調(diào)Bcl-2/Bax的比例,上調(diào)Cleaved caspase-3、Cleaved-PARP的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。3.SHH基因干擾影響視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖凋亡的分子機(jī)制目的:明確SHH基因沉默對WERI-Rb-1細(xì)胞中PI3K/Akt信號通路的調(diào)控作用以及SHH基因是否通過PI3K/Akt通路影響WERI-Rb-1細(xì)胞增殖和凋亡。方法:Western blot檢測WERI-Rb-1組、NC組和SHH-sh RNA組中p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt的表達(dá),驗證SHH基因沉默對PI3K/Akt通路具有調(diào)控作用后,采用PI3K/Akt通路激活劑進(jìn)行干預(yù),實驗設(shè)置NC組、SHH-sh RNA組、NC+IGF-1組和SHH-sh RNA+IGF-1組,Western blot檢測p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt的表達(dá),驗證IGF-1可以激活PI3K/Akt通路,MTT檢測IGF-1處理對SHH基因沉默的WERI-Rb-1細(xì)胞增殖的影響,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡,Western blot檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase-3、Cleaved-PARP、Bcl-2、Bax的表達(dá)。結(jié)果:Western blot檢測結(jié)果顯示SHH基因沉默的WERI-Rb-1細(xì)胞中p-PI3K和p-Akt表達(dá)顯著降低,使用IGF-1處理后p-PI3K和p-Akt表達(dá)增加。MTT及流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示與SHH-sh RNA組相比,SHH-sh RNA+IGF-1組細(xì)胞增殖能力顯著增加,細(xì)胞凋亡率下降,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。Western blot檢測結(jié)果顯示SHH-sh RNA+IGF-1組細(xì)胞中Cleaved caspase-3、Cleaved-PARP、Bax表達(dá)下降(P0.01),Bcl-2表達(dá)水平增加(P0.05)。結(jié)論:SHH基因沉默抑制WERI-Rb-1細(xì)胞中PI3K/Akt通路的激活。SHH基因可能通過激活PI3K/Akt信號通路,上調(diào)細(xì)胞中Bcl-2/Bax的比例,抑制Cleaved caspase-3、Cleaved-PARP的表達(dá)促進(jìn)WERI-Rb-1細(xì)胞增殖,抑制凋亡。
[Abstract]:This study shows that the expression of SHH gene is one of three homologous genes of Hedgehog ( HH ) . The expression of SHH - sh RNA - 1 , SHH - sh RNA - 1 , SHH - sh RNA - 3 and negative control plasmid were studied . The results showed that SHH - sh RNA - 1 , SHH - sh RNA - 1 , SHH - sh RNA - 3 and negative control plasmid were constructed . The effects of SHH gene silencing on the proliferation and apoptosis of the cells were studied by MTT assay . The results showed that SHH gene silencing inhibited the proliferation of caspase - 3 , C - 2 / Bax in SHH - sh RNA + IGF - 1 cells . The results showed that SHH - sh RNA + IGF - 1 had a significant decrease in the expression of caspase - 3 , C - 2 / Bax , and the expression of Bcl - 2 / Bax was detected by Western blot . Results : Western blot showed that SHH - sh RNA + IGF - 1 had a significant decrease in the expression of Bcl - 2 / Bax .

【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R739.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1472582