發(fā)布時間：2018-01-20 22:08

  本文關(guān)鍵詞： 喉腫瘤 鱗狀細(xì)胞癌 增殖 miR-497 CDK6 PlexinA4 預(yù)后　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:查詢喉鱗狀細(xì)胞癌micro RNA表達(dá)譜,選定miR-497進行研究;研究miR-497和CDK6、Plexin A4在喉鱗癌及癌旁正常黏膜新鮮標(biāo)本和細(xì)胞株中的表達(dá)情況及相關(guān)性,結(jié)合臨床病理參數(shù)評價它們的臨床意義及與預(yù)后的關(guān)系;利用生物信息學(xué)方法預(yù)測miR-497下游靶基因,隨后驗證;研究miR-497對喉鱗癌細(xì)胞增殖、克隆、侵襲和細(xì)胞周期的影響及CDK6、Plexin A4對喉鱗癌細(xì)胞增殖、克隆、侵襲和細(xì)胞周期的影響,明確它們的生物學(xué)功能。方法:利用qRT-PCR和免疫組織化學(xué)方法在喉鱗癌及癌旁正常黏膜新鮮標(biāo)本中觀察miR-497和靶基因CDK6、Plexin A4表達(dá)情況;將miR-497和CDK6、Plexin A4表達(dá)情況與臨床病理參數(shù)、術(shù)后隨訪資料相結(jié)合,評價它們的臨床意義及與預(yù)后的關(guān)系;通過生物信息學(xué)預(yù)測miR-497的靶基因CDK6、Plexin A4,利用雙熒光素酶報告基因檢測的方法驗證它們的靶向調(diào)控關(guān)系;利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將miR-497模擬物轉(zhuǎn)染至喉鱗癌細(xì)胞,通過MTT法、平板克隆形成實驗、劃痕實驗、Transwell法、流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)手段,觀察miR-497對喉鱗癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響;通過裸鼠移植瘤模型觀察miR-497抑制腫瘤效果;采用RNA干擾技術(shù)將CDK6si RNA、Plexin A4si RNA轉(zhuǎn)染至喉鱗癌細(xì)胞,通過MTS法觀察CDK6si RNA、Plexin A4 si RNA對喉鱗癌細(xì)胞增殖的影響;通過過表達(dá)實驗構(gòu)建pc DNA3.1(+)CDK6,pc DNA3.1(+)Plexin A4過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至喉鱗癌細(xì)胞,通過MTS法觀察pc DNA3.1(+)CDK6,pc DNA3.1(+)Plexin A4對喉鱗癌細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果:miR-497喉鱗癌中低表達(dá),在中低分化喉鱗癌中,以及有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的喉鱗癌中miR-497低表達(dá)例數(shù)在所占百分比顯著增高(P0.05),相反,在高分化以及無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組中miR-497低表達(dá)例數(shù)所占百分比顯著降低(P0.05);miR-497的表達(dá)情況與年齡、性別、原發(fā)部分、T分期、腫瘤大小及術(shù)前吸煙均無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。CDK6及Plexin A4在喉癌中高表達(dá)。miR-497與CDK6,Plexin A4表達(dá)在喉鱗癌中呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。經(jīng)Kaplan-Meier法行生存分析并進行Log-rank檢驗,miR-497高表達(dá)組患者的預(yù)后好于miR-497低表達(dá)組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=10.342,P=0.001);Cox回歸分析顯示miR-497低表達(dá)的相對危險度為2.262(95%CI為0.151~0.732,P=0.033),是喉鱗癌患者預(yù)后的獨立影響因素。野生型(CDK6 Wt 3’-UTR組,plexin A4 Wt 3’-UTR組)熒光活性變化倍數(shù)與對照組的熒光活性變化倍數(shù)相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。而突變型(CDK6Mut 3’-UTR組,plexin A4 Mut 3’-UTR組)組的熒光活性倍數(shù)與對照組的熒光活性變化倍數(shù)比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。體外實驗中,miR-497 mimics作用Hep-2、TU-212細(xì)胞后,細(xì)胞生長受到明顯抑制,平板克隆形成能力受到遏制,G0/G1細(xì)胞數(shù)百分比增加,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P0.05)。體內(nèi)實驗中,miR-497 agomir實驗組腫瘤生長速度較NC agomir對照組及Blank空白對照組慢,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。CDK6 si RNA2以及plexin A4 si RNA2作用Hep-2、TU-212細(xì)胞后,細(xì)胞生長受到明顯抑制,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。pc DNA3.1(+)/CDK6以及pc DNA3.1(+)/plexin A4組作用后的Hep-2、TU-212細(xì)胞生長受到明顯促進,穿過小室的遷移細(xì)胞數(shù)目明顯高于對照組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P0.01)。結(jié)論:1、miR-497在喉鱗癌中顯著下調(diào),具有抑癌基因的作用,而CDK6、PlexinA4在喉鱗癌組織中顯著升高,具備癌基因作用。同時伴有miR-497低表達(dá)的個體預(yù)后不良,且這一分子特征是喉鱗癌患者預(yù)后的獨立危險因素。2、CDK6,PlexinA4是miR-497的靶基因,miR-497對CDK6、PlexinA4存在靶向調(diào)控作用。3、在體外miR-497對于喉鱗癌細(xì)胞增殖、克隆、遷移和侵襲有抑制作用,可將細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。在體內(nèi)可以抑制裸鼠皮下荷Hep-2瘤的生長。4、CDK6 si RNA,Plexin A4 si RNA對于喉鱗癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲有抑制作用。5、pc DNA3.1(+)/CDK6和pc DNA3.1(+)/PLEXINA4對于喉鱗癌細(xì)胞增殖、侵襲以及克隆形成能力有正向促進作用。并促進喉鱗癌細(xì)胞進入S期。6、miR-497通過調(diào)控其靶基因CDK6、Plexin A4參與了喉鱗癌的發(fā)生發(fā)展,為揭示喉鱗癌的發(fā)病機制提供新的理論依據(jù),可為喉鱗癌的治療提供新的分子靶點。
[Abstract]:Objective : To investigate the expression of miR - 497 and its relationship with prognosis in laryngeal squamous cell carcinoma ( SCC ) and adjacent normal mucosa of laryngeal squamous cell carcinoma ( SCC ) . The expression of miR - 497 was significantly lower than that in control group ( P0.05 ) . The expression of miR - 497 was significantly lower than that of control group ( P0.05 ) . Conclusion : 1 . The expression of miR - 497 in laryngeal squamous cell carcinoma is significantly higher than that in the control group .

【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R739.65

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本文編號：1449566