本文關(guān)鍵詞： 視網(wǎng)膜色素變性 利伯氏先天性黑蒙 Crb蛋白 蛋白結(jié)構(gòu)域 斑馬魚 基因重組 基因治療　出處：《浙江大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：感光細(xì)胞退行性病變是人類的一種常見致盲性疾病,嚴(yán)重危害人類健康,但目前針對這類疾病仍沒有良好的醫(yī)療手段�，F(xiàn)今,基因治療和干細(xì)胞治療是兩類具有較好前景的治療方案。在人類諸多與視網(wǎng)膜退行性病變相關(guān)的基因當(dāng)中,CRB1基因不同位點的突變可以引起視網(wǎng)膜色素變性(Retinitis pigmentosa, RP)和利伯氏先天性黑蒙(Leber congenital amaurosis, LCA),但目前尚未有關(guān)于此基因突變進行基因治療的報道,主要原因之一是CRB1基因比較大,不符合基因治療的載體腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus, AAV)對基因片段大小的要求,且其編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜,各結(jié)構(gòu)域的功能尚不十分明確。鑒于此,本論文旨在以斑馬魚為模型,分析其Crb2a蛋白各結(jié)構(gòu)域的功能,在此基礎(chǔ)上探索對人類因CRB1功能缺陷引起的RP和LCA的基因治療方案。方法：首先,通過生物信息學(xué)比較斑馬魚不同Crb異構(gòu)體與哺乳動物CRB1之間的同源性,確定crb2a為斑馬魚中與哺乳動物CRB1同源的基因。然后,對斑馬魚Crb2a蛋白的各結(jié)構(gòu)域分區(qū)進行預(yù)測,結(jié)合對比分析自然界原本存在的不同異構(gòu)體,分別克隆各單個結(jié)構(gòu)域或結(jié)構(gòu)域組合,在斑馬魚和細(xì)胞中分別檢測其對crb2a突變魚系表型的修復(fù)情況,介導(dǎo)蛋白——蛋白自身粘連的能力等,以此研究Crb2a各結(jié)構(gòu)域的功能。在此基礎(chǔ)上,選擇基因大小適宜且保留Crb2a功能的重組形式,通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)在斑馬魚中驗證對CRB1突變引起的視網(wǎng)膜疾病進行基因治療的可行性。結(jié)果：生物信息學(xué)分析表明, crb2a具有3個Laminin G結(jié)構(gòu)域和16個EGF結(jié)構(gòu)域。同時,盡管自然界中獲得廣泛認(rèn)可的具有功能的Crb蛋白通常由以上結(jié)構(gòu)域組成,但cDNA克隆表明crb2a具有多種不同的剪接轉(zhuǎn)錄形式。在此基礎(chǔ)上,我們通過基因工程技術(shù),獲得了8種不同結(jié)構(gòu)域組合的重組crb2a。經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄成mRNA后,顯微注射到斑馬魚胚胎中,觀察是否能修復(fù)crb2a突變魚系表型。結(jié)果證明了Crb2a的各個結(jié)構(gòu)域具有相對獨立功能,不同重組形式的Crb2a在不同的臟器展現(xiàn)出不同的修復(fù)效果。結(jié)論：本研究初步證明crb2a的多個結(jié)構(gòu)域具有相對獨立功能,通過重組crb2a基因,有望獲得基因大小合適AAV載體,且能保留全長crb2a基本功能的修改形式,為基因治療人類與CRB1相關(guān)的疾病提供新的條件。
[Abstract]:Objective: photoreceptor cell degenerative disease is a common blind disease in human, which seriously endangers human health, but there is still no good medical treatment for this kind of disease. Gene therapy and stem cell therapy are two promising therapies. Mutations at different sites of the CRB1 gene can cause retinitis pigmentosa. RPand Leber congenital amaurosis, LCAA, but there are no reports of gene therapy for this mutation. One of the main reasons is that the CRB1 gene is relatively large and does not accord with the gene therapy vector adeno-associated virus (Adeno-associated virus). AAVs require the size of gene fragments, and the structure of proteins encoded by AAVs is complex, and the functions of each domain are not very clear. In view of this, the purpose of this paper is to use zebrafish as a model. On the basis of analyzing the function of Crb2a protein domains, the gene therapy of RP and LCA caused by CRB1 functional defect was explored. Methods: first of all. By comparing the homology between different Crb isomers of zebrafish and mammalian CRB1, crb2a was identified as a gene homologous to mammalian CRB1 in zebrafish. The domain zoning of zebrafish Crb2a protein was predicted and the different isomers existed in nature were compared and cloned into a single domain or domain combination. The phenotypic repair of crb2a mutant fish and its ability to mediate protein-protein self-adhesion were detected in zebrafish and cells respectively. The function of each domain of Crb2a was studied. On the basis of this, the recombination forms of gene size and Crb2a function were selected. The feasibility of gene therapy for retinal diseases caused by CRB1 mutation was verified in zebrafish by transgenic technology. Results: bioinformatics analysis showed. Crb2a has three Laminin G domains and 16 EGF domains. Meanwhile, although widely recognized in nature, functional Crb proteins are usually composed of these domains. However, cDNA cloning shows that crb2a has many different splicing transcriptional forms. On this basis, we use genetic engineering technology. Eight recombinant crb2as with different domain combinations were obtained. After transcribed into mRNA in vitro, they were microinjected into zebrafish embryos. It was observed whether the phenotype of crb2a mutant fish could be repaired. The results showed that each domain of Crb2a had relatively independent function. Different recombination forms of Crb2a showed different repair effects in different organs. Conclusion: this study preliminarily proves that multiple domains of crb2a have relatively independent functions. By recombination of crb2a gene, it is expected that the gene is suitable for AAV vector and can retain the modified form of the basic function of full-length crb2a. It provides new conditions for gene therapy of human CRB1 related diseases.
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R774.1

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本文編號：1446584