本文關鍵詞： 隱性 遺傳性 耳聾 外顯 測序 技術 基因 鑒定 基因型 表型 關聯(lián) 研究　出處：《中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院》2012年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：遺傳性耳聾嚴重影響人類學習交流和社會活動，，是亟待解決的日益嚴重的健康問題。預防耳聾出生缺陷，提高人口素質是關系國計民生的重大問題，而預防的根本，就是深入了解遺傳基因及其突變譜，發(fā)現(xiàn)中國人群的耳聾基因分布和熱點突變，從而能夠在人們的婚育指導上進行預測，提早進行預防。目前中國大部分聾人表現(xiàn)為隱性遺傳性耳聾，而其中60-70%尚無法明確致聾基因。本研究利用了當前蓬勃發(fā)展的新一代測序技術，針對非綜合征遺傳性耳聾的隱性遺傳小家系進行了病因研究，發(fā)現(xiàn)了在國際上發(fā)病率居2-3位的CDH23基因為負責基因，并發(fā)現(xiàn)了新突變。同時，在當前很多耳聾基因得到鑒定的背景下，本研究針對常見隱性遺傳性耳聾基因GJB2和SLC26A4，對致聾基因型與臨床表型進行了關聯(lián)分析，在一定程度上闡釋了基因型對表型的影響及對臨床診療的指導意義。 第一部分利用外顯子測序技術發(fā)現(xiàn)隱性遺傳性耳聾致聾基因CDH23 一、外顯子測序技術在3個隱性遺傳性耳聾家系中的應用本研究選擇了3個隱性遺傳性耳聾的核心家系，家系中僅第三代有兩例耳聾患者。首先進行了常見隱性耳聾基因和突變的篩查（GJB2、SLC26A4和線粒體DNA1555AG），未發(fā)現(xiàn)攜帶突變。然后，在784和845家系中，分別選擇了兩個患者和父母，在855家系中，因父親亡故，選了兩個患者和同胞弟弟，叔叔，及母親，進行了全外顯子測序。 測序結果的質控報告顯示，測序深度達到50X，外顯子長度達到3千萬堿基左右，達到了人類全部外顯子99%以上覆蓋率。每個樣本經(jīng)過篩選，高可信度的數(shù)據(jù)如下：95000個左右的單核苷酸變異（SNP），2500個左右的剪接位點突變（splice site）,7000左右的插入缺失突變（indel），58000左右的在外顯子臨近10bp以內的內含子突變（intron）。 根據(jù)目前已經(jīng)公開的數(shù)據(jù)庫進行了SNPs過庫篩選分析，所采用的數(shù)據(jù)庫包括dbSNP數(shù)據(jù)庫、Hapmap-8數(shù)據(jù)庫、1000Genomes、YanHuang (YH)。首先針對每個家系中每個樣本的變異與各個數(shù)據(jù)庫分別比對，篩選出所有數(shù)據(jù)庫均沒有報道的罕見變異；然后再把家系的正常人作為對照進行比對，根據(jù)疾病表型和基因型共分離的原理，篩選患者中純合，而在父母或同胞雜合的變異，即得到候選基因的位點。對候選基因位點，選擇在多物種間（大鼠、小鼠、狗、猴、雞、象、X_嗜熱病毒、斑馬魚）保守區(qū)域的5個堿基以內的插入缺失突變、剪接區(qū)、無義突變、經(jīng)SIFT判定為具有蛋白質功能損害性的（damaging）的錯義突變作為首選。 在784家系中，未發(fā)現(xiàn)符合上述條件的候選基因位點。在845家系中，發(fā)現(xiàn)了已知致聾基因CDH23的73553127位置發(fā)生的GA突變（c.6442GA，p.D2148N），是已在多個人種中報道過的致聾錯義突變。在855家系中，發(fā)現(xiàn)已知致聾基因CDH23的73270943位置發(fā)生CT突變（c.403CT, p.Q135*），為終止突變，據(jù)多物種間序列保守性預測，可對蛋白質功能產(chǎn)生巨大影響。因此，845和855家系均是已知致聾基因CDH23突變導致的，其中c.6442GA為已知突變，c.403CT為新突變。 二、CDH23基因新突變驗證及分子流行病學研究 855號樣本經(jīng)過眼科學檢查，發(fā)現(xiàn)該患者伴發(fā)嚴重的視網(wǎng)膜色素變性，符合Usher1D綜合征的診斷，CDH23基因正是該疾病的負責基因。在100例正常人群對照中，篩查c.403CT，未發(fā)現(xiàn)該突變。 本課題組收集到來自中國北方地區(qū)的108余例隱性遺傳聾核心家系（包括855家系），進行常見隱性耳聾基因GJB2、SLC26A4的全測序研究，篩查了線粒體DNA A1555G，未發(fā)現(xiàn)攜帶已知突變。 鑒于CDH23基因為非綜合征型遺傳性耳聾（NSHL）較為常見的致病基因，經(jīng)文獻復習，查找到與NSHL中隱性耳聾DFNB12相關的CDH23基因29個突變，廣泛分布于美國、德國、荷蘭、日本、印度、巴基斯坦和阿爾及利亞等世界范圍內的高加索人、非洲人和蒙古人種，人種間突變譜差異較大。利用Sequenom公司的基于質譜原理的MassARRAY時間飛行質譜生物芯片系統(tǒng)，在108個家系的患者中進行了CDH23基因與DFNB12相關的已知突變的篩查，并在855號樣本中驗證了新突變的存在。結果發(fā)現(xiàn)：3例單等位基因突變攜帶者，再結合外顯子測序發(fā)現(xiàn)的1例純合子，則CDH23基因在該樣本中的NSHL相關等位基因突變率為2.31%（5/216）。 第二部分隱性遺傳性耳聾患者中常見致聾基因GJB2和SLC26A4基因型與表型關聯(lián)分析 一、295例GJB2雙等位基因突變耳聾基因型表型分析 縫隙連接蛋白編碼基因GJB2是非綜合征型感音神經(jīng)性耳聾(NSSHI)最常見的致病基因。該基因已有超過100種以上的突變被報道與耳聾相關，耳聾級別表現(xiàn)從輕中度到極重度均有覆蓋。為評估中國人群中GJB2基因型對耳聾表型的影響，本研究在中國北方NSSHI人群中進行了橫斷面研究。 本研究納入了295例攜帶GJB2雙等位基因突變的中國北方七省的遺傳性耳聾患者。以突變是否導致基因功能缺失將突變分為截短型（T）和非截短型（NT），將雙等位基因型分為截短組（T+T），復合雜合截短組(T+NT)，和非截短組(NT+NT)。每個基因型組的耳聾純音測聽平均聽閾（PTA）進行了χ2卡方檢驗。發(fā)現(xiàn)截短組的耳聾程度顯著超過非截短組。同時發(fā)現(xiàn)具有基因型c.[79GA;341AG]+[79GA;341AG]或c.[109GA]+[79GA;341AG]的患者其耳聾程度顯著輕于c.235delC純合子組，而具有c.[235delC]+[176_191del16]基因型的患者則顯著重于c.235delC純合子組。 二、272例兒童大前庭水管患者的基因型表型分析 本研究擬初步繪制兒童大前庭水管綜合征患者的基因突變譜，并闡釋其基因型對耳聾及內耳結構的影響。 12歲以下的272名大前庭水管綜合征患兒納入研究，進行了SLC26A4基因測序。其中266例接受了全套聽力學檢查，可獲得平均聽閾的數(shù)據(jù)，這其中，有152例患兒的高分辨率顳骨CT進行了詳細測量。根據(jù)患者攜帶突變數(shù)量，分為雙等位基因型，單等位基因型和無突變型，其中雙等位基因型，再根據(jù)突變性質，分為雙等位基因截短組，雙等位基因復合雜合截短組，雙等位基因非截短組。臨床表型數(shù)據(jù)包括PTA，每個族群患者數(shù)量，前庭水管中段和外口直徑等。 使用統(tǒng)計學軟件SPSS15.0，將基因型數(shù)據(jù)和表型數(shù)據(jù)進行了關聯(lián)分析，使用方法為計量資料t檢驗和計數(shù)資料卡方檢驗。 本組研究人群中，共發(fā)現(xiàn)SLC26A4基因的69種突變，其中2種為新突變(c.665GT和c.1639AG)。207例患者為雙等位基因突變，56例為單等位基因突變，8例未發(fā)現(xiàn)突變，1例攜帶3個突變。經(jīng)過統(tǒng)計學比較，發(fā)現(xiàn)單等位基因組的患者耳聾程度更為穩(wěn)定(P0.05)。雙等位基因非截短組的患者比雙等位基因截短組，復合雜合截短組和單等位基因組更容易出現(xiàn)氣骨導差(所有P值0.05)。 不同基因型組之間的前庭水管尺寸則沒有明顯差異(所有P值0.05)。不同前庭水管尺寸的患者之間耳聾嚴重程度也沒有明顯差異(所有P值0.05)。 本研究發(fā)現(xiàn)前庭導水管綜合征的兒童中98%攜帶SLC26A4基因突變。雖然本研究發(fā)現(xiàn)了基因型與表型之間的一些關系，但是真正揭示基因型對表型的影響還有很遠的距離。
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【學位授予單位】：中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R764.43;R440

【引證文獻】

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1 陸樹健;人類全基因組外顯子芯片檢測口腔癌單核苷酸多態(tài)性的初步研究[D];廣西醫(yī)科大學;2014年

本文編號：1446230