本文關(guān)鍵詞：TLR2調(diào)控角膜移植術(shù)后MDSC分化及DC成熟　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：研究背景角膜移植手術(shù)是目前治療不可逆性角膜盲唯一有效手段。盡管角膜一直被稱作“免疫赦免”組織,但移植術(shù)后的免疫排斥反應(yīng)仍是導(dǎo)致移植失敗最主要的原因。角膜移植排斥反應(yīng)是以CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)為主的Th1型免疫反應(yīng)。干擾素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)的增高決定T細(xì)胞向Th1方向分化,是Th1型免疫反應(yīng)的特征性因子。CD4+T細(xì)胞的激活不僅需要T細(xì)胞表面受體(T cell receptor,TCR)-主要組織相容性抗原(Major histocompatibility complex,MHC)肽復(fù)合體的結(jié)合,還需要抗原提呈細(xì)胞(Antigen-presenting cell,APC)提呈抗原。骨髓抑制性細(xì)胞(Myeloid-derived suppressor cell,MDSC)是 APC 的前體,不具備抗原提呈功能,無法激活T細(xì)胞。另外,MDSC也可通過多種途徑抑制T細(xì)胞活化。其中最主要的途徑是分泌誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(Inducednitricoxide synthase,INOS),降低T細(xì)胞活性。樹突狀細(xì)胞(Dendriticcell,DC)是目前認(rèn)為最有效的APC。成熟后的DC(Mature DC,mDC),表面高表達(dá)B7/BB1(CD80/CD86)分子,這是遞呈抗原從而激活T細(xì)胞的必備條件。因此,MDSC、DC的產(chǎn)生和活化與CD4+T細(xì)胞激活關(guān)系十分密切。Toll樣受體(Toll like receptor,TLR)2是廣泛表達(dá)于免疫細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體。我們課題組前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn),TLR2可能參與了大鼠角膜移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生,但其具體機(jī)制仍不十分明確。在體外實(shí)驗(yàn)中,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)激活TLR2可以促進(jìn)MDSC向DC分化,并對(duì)MDSC活化和DC成熟有一定影響。因此我們猜測(cè)TLR2可能通過調(diào)控MDSC分化和DC成熟參與角膜移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)將利用TLR2基因敲除小鼠建立同種異體角膜移植模型,與野生型同種異體角膜移植小鼠進(jìn)行比較,從而驗(yàn)證TLR2與角膜移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)發(fā)生的關(guān)系,并進(jìn)一步探究這一現(xiàn)象背后的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)一 TLR2敲除后可延長角膜植片生存時(shí)間研究目的驗(yàn)證TLR2參與角膜移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生。研究方法以野生型C57BL/6和TLR2基因敲除小鼠為受體,BABL/c小鼠為供體,在受體小鼠右眼行同種異體角膜移植術(shù),分別設(shè)為野生組(WT組)和基因敲除組(TLR2KO組);另外于C57BL/6小鼠右眼行自體角膜移植術(shù),設(shè)為自體組(ISO組)。未經(jīng)手術(shù)處理的C57BL/6和TLR2基因敲除小鼠分別設(shè)為野生對(duì)照組(WT control)和基因敲除對(duì)照組(KO control)。術(shù)后2次/周裂隙燈下觀察植片水腫程度和透明度,參照Sonoda評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)排斥指數(shù)(Reject index,RI)進(jìn)行評(píng)分并計(jì)算中位生存時(shí)間(Median survival time,MST)。比較WT組與TLR2 KO組間植片生存時(shí)間長短。研究結(jié)果術(shù)后隨時(shí)間變化各手術(shù)組植片水腫和混濁程度不一,以WT組最為嚴(yán)重。比較角膜 RI 評(píng)分顯示,術(shù)后 7d、14d、21d、28d、35d、42d、49d和56d,TLR2 KO組RI評(píng)分均低于WT組(P0.05)。比較MST結(jié)果顯示,TLR2 KO組(35.0±3.8)d明顯長于WT組(21.0±1.5)d(P0.05)。生存分析結(jié)果顯示,TLR2 KO組角膜生存時(shí)間明顯長于WT組(P0.001),術(shù)后14d TLR2 KO組角膜生存率為100%,而WT組僅為70%。結(jié)論TLR2敲除后可延長角膜植片生存時(shí)間,再次驗(yàn)證TLR2可能參與角膜移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)二TLR2調(diào)控角膜植片局部免疫反應(yīng)發(fā)生研究目的探究TLR2是否調(diào)控同種異體移植角膜植片局部的免疫反應(yīng)的發(fā)生。研究方法建立WT組、TLR2 KO組、ISO組、WT control組和KO control組五組小鼠(方法同前)。術(shù)后14d,收集術(shù)眼角膜行HE染色分析炎癥細(xì)胞浸潤程度;免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)角膜TLR2及Thl細(xì)胞因子(IFN-γ)蛋白表達(dá);實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TLR2及IFN-y mRNA的表達(dá);同時(shí)收集術(shù)眼同側(cè)頸部淋巴結(jié)行流式細(xì)胞術(shù)分析CD4+T細(xì)胞(CD3+CD4+)的比例。研究結(jié)果TLR2免疫組織化學(xué)和PCR結(jié)果顯示,TLR2 KO組角膜幾乎不表達(dá)TLR2分子,ISO組有微量表達(dá),WT組表達(dá)明顯增高。HE染色結(jié)果顯示,WT組角膜基質(zhì)層出現(xiàn)水腫和大量炎性細(xì)胞,而TLR2KO組炎癥反應(yīng)較輕。流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示,WT組同側(cè)頸部淋巴結(jié)中CD4+T細(xì)胞數(shù)量明顯高于TLR2KO組(P0.05)。免疫組織化學(xué)和PCR結(jié)果顯示,WT組相對(duì)于TLR2KO組,角膜植片內(nèi)IFN-y表達(dá)增高(P0.05)。結(jié)論TLR2表達(dá)高低與植片局部免疫反應(yīng)強(qiáng)弱相關(guān),提示TLR2可能參與了同種異體移植角膜植片局部的免疫反應(yīng)的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)三TLR2調(diào)控MDSC分化及DC成熟研究目的探究TLR2是否調(diào)控MDSC分化及DC成熟。研究方法建立WT組、TLR2 KO組、ISO組、WT control組和KO control組五組小鼠(方法同前)。術(shù)后14d,收集術(shù)眼角膜行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)INOSmRNA表達(dá)分析各組MDSC功能差異;免疫熒光染色檢測(cè)角膜局部MDSC、DC數(shù)量分析各組MDSC向DC分化的情況,以及CD80/CD86表達(dá)強(qiáng)弱分析各組DC成熟的情況。同時(shí)收集術(shù)眼同側(cè)頸部淋巴結(jié)行流式細(xì)胞術(shù)定量分析MDSC(CD11b+GR-1+)、DC(CD11c+)的比例和和 mDC(CD11c+CD86high/CD80high)的表達(dá)。研究結(jié)果PCR結(jié)果顯示,WT組與TLR2 KO組間角膜局部INOS mRNA表達(dá)無明顯的差異(P0.05)。MDSC和DC的流式細(xì)胞分析和免疫熒光結(jié)果結(jié)果顯示,WT組相對(duì)于TLR2KO組,眼球局部MDSC數(shù)量減少(P0.05),但DC的數(shù)量增多(P0.05)。流式細(xì)胞分析結(jié)果和免疫熒光結(jié)果均顯示,WT組相對(duì)于TLR2 KO組,DC表面CD86/CD80分子表達(dá)高(P0.05),DC成熟度高。結(jié)論TLR2可能參與了角膜移植術(shù)后MDSC向DC分化及DC成熟,但TLR2缺乏并不影響MDSC活化。
[Abstract]:In vitro experiments , it has been found that TLR2 can promote the differentiation of immune rejection after corneal transplantation . In addition , C57BL / 6 and TLR2 knockout mice were divided into wild control group ( WT control ) and knockout control group ( KO control ) . The degree of edema and the transparency of the implant were observed at 2 / week after operation , and the rejection index ( RI ) was scored and the median survival time ( MST ) was calculated with reference to the Sonoda scoring standard . The results showed that TLR2 KO group ( 33.0 鹵 3.8 ) d was significantly longer than that in WT group ( P0.05 ) . The expression of MDSC ( CD11c + ) , DC ( CD11c + ) and DC ( CD11c + CD86high / CD80high ) were analyzed by flow cytometry . The results showed that TLR2 could be involved in the differentiation of MDSCs to DC and DC maturation relative to TLR2 KO group . Conclusion TLR2 may be involved in DC differentiation and DC maturation in WT group compared with TLR2 KO group , but TLR2 lacks and does not affect MDSC activation .

【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R779.65

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1439330