本文關(guān)鍵詞：抑制乙酰膽堿酯酶對(duì)視網(wǎng)膜炎癥保護(hù)作用及機(jī)制的研究　出處：《南昌大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：多種致盲性眼病如葡萄膜炎、糖尿病視網(wǎng)膜病變、年齡相關(guān)性黃斑變性、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變等病理生理過程都涉及炎癥反應(yīng)。炎癥是一種非特異性的防御反應(yīng),不僅各種各樣的分子和功能會(huì)改變,而且還發(fā)生白細(xì)胞的募集和粘附。在急性期,白細(xì)胞募集可以清除入侵的有害因素,通常導(dǎo)致組織修復(fù)。然而,如果炎癥持續(xù),白細(xì)胞粘附及長期分泌的化學(xué)介質(zhì)會(huì)損傷組織。視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)常導(dǎo)致視網(wǎng)膜組織水腫、出血和滲出,可引起視力不同程度的下降。研究發(fā)現(xiàn)主要集中在突觸等神經(jīng)組織、可迅速水解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿(Acetylcholine,ACh)的乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)可作為系統(tǒng)炎癥的標(biāo)記物,其基因可以啟動(dòng)DNA結(jié)合位點(diǎn),可能在募集核轉(zhuǎn)錄因子(Nuclear Factor-Kappa B,NF-кВ)過程中參與炎癥反應(yīng),在機(jī)體多種器官、組織、細(xì)胞的炎癥反應(yīng)中呈現(xiàn)高表達(dá);即使在腦脊液、血漿、組織中的其他炎性標(biāo)志物升高不明顯的炎癥反應(yīng)中,AChE的表達(dá)也會(huì)明顯增加;且多個(gè)研究表明,AChE抑制劑在細(xì)胞水平和分子水平都有抗炎的功能,可抑制淋巴細(xì)胞增殖、促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及細(xì)胞外的酯酶的活動(dòng)。本課題研究目的是明確AChE在視網(wǎng)膜炎癥中的作用及抑制AChE對(duì)視網(wǎng)膜炎癥的影響,并探討其中可能機(jī)制。實(shí)驗(yàn)使用ARPE-19細(xì)胞系、AChE基因敲除小鼠及給予AChE抑制劑灌胃C57BL/6J小鼠,研究AChE基因及蛋白水平的變化對(duì)視網(wǎng)膜炎癥的影響,并且重點(diǎn)分析了這種影響與經(jīng)典NF-кВ通路的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)AChE作為主要分布于神經(jīng)組織的水解酶,參與視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng),抑制AChE可以減輕視網(wǎng)膜炎癥對(duì)視網(wǎng)膜炎癥有保護(hù)作用,并且這種作用可能是通過經(jīng)典抑制NF-кВ經(jīng)典通路實(shí)現(xiàn)的,這將有利于我們尋找干預(yù)和治療視網(wǎng)膜炎癥的新靶點(diǎn)。第一部分抑制AChE對(duì)視網(wǎng)膜炎癥的影響目的:探討抑制AChE對(duì)視網(wǎng)膜炎癥的影響。方法:(1)細(xì)胞實(shí)驗(yàn):體外培養(yǎng)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系(ARPE-19),使用AChE抑制劑(多奈哌齊)及AChE si RNA抑制AChE的表達(dá)后,利用TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥(4小時(shí)及24小時(shí)),采用細(xì)胞爬片免疫熒光及蛋白免疫印跡技術(shù)測(cè)定AChE及ICAM-1的表達(dá)情況;(2)動(dòng)物實(shí)驗(yàn):○1取2月齡健康雌性C57BL/6J小鼠利用多奈哌齊10mg/kg或相同劑量1XPBS連續(xù)灌胃3天后1只眼給予玻璃體腔注射TNF-α1μl(50ng/ml)誘導(dǎo)動(dòng)物視網(wǎng)膜炎癥,另一只眼均給予1XPBS 1μl,將視網(wǎng)膜分為Vehicle組、Vehicle+TNF-α組、Donepezil組及Donepezil+TNF-α組,24h后處死小鼠,檢測(cè)指標(biāo)同模型1�！�2取2月齡健康雌性AChE+/-和AChE+/+小鼠1只眼均給予玻璃體腔注射TNF-α1μl(50ng/ml)誘導(dǎo)動(dòng)物視網(wǎng)膜炎癥,另一只眼均給予1XPBS 1μl,將視網(wǎng)膜分為AChE+/+組、AChE+/++TNF-α組、AChE+/-組、AChE+/-+TNF-α組,24h后處死小鼠,取小鼠視網(wǎng)膜或視杯,利用蛋白免疫印跡及免疫熒光技術(shù)和白細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn),檢測(cè)相關(guān)炎癥指標(biāo)的表達(dá);結(jié)果:(1)細(xì)胞實(shí)驗(yàn):在TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥中,AChE、ICAM-1的表達(dá)上調(diào),當(dāng)使用多奈哌齊或AChE si RNA抑制AChE的表達(dá)后,AChE、ICAM-1的表達(dá)下調(diào)且呈最適濃度為10μM;(2)動(dòng)物實(shí)驗(yàn):給予TNF-α玻璃體腔注射后,AChE+/-+TNF-α組AChE、ICAM-1、Albumin、CD11b的表達(dá)及白細(xì)胞粘附較AChE+/++TNF-α組低、而C57BL/6J小鼠模型以上指標(biāo),Donepezil+TNF-α組較Vehicle+TNF-α組低。結(jié)論:抑制AChE對(duì)視網(wǎng)膜炎癥有保護(hù)作用。第二部分抑制AChE對(duì)視網(wǎng)膜炎癥保護(hù)作用的機(jī)制研究目的:探討抑制AChE對(duì)視網(wǎng)膜炎癥保護(hù)作用的機(jī)制。方法:(1)細(xì)胞實(shí)驗(yàn):體外培養(yǎng)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系(ARPE-19),使用AChE抑制劑(多奈哌齊)及AChE si RNA抑制AChE的表達(dá)后,利用TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥(5分鐘及30分鐘),采用細(xì)胞爬片免疫熒光及蛋白免疫印跡技術(shù)及測(cè)定NF-кВ經(jīng)典通路相關(guān)抗體的表達(dá)情況;(2)動(dòng)物實(shí)驗(yàn):方法同第一部分,采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)NF-кВ表達(dá)。結(jié)果:(1)細(xì)胞實(shí)驗(yàn):細(xì)胞爬片免疫熒光結(jié)果顯示,給予TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥30分鐘時(shí),NF-кВ入核表達(dá)增高,當(dāng)使用多奈哌齊或AChE si RNA后,NF-кВ入核表達(dá)降低;蛋白免疫印跡技術(shù)結(jié)果顯示,給予TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥5分鐘及30分鐘時(shí),p-NF-кВ、p-IKK、p-IкВα的表達(dá)上調(diào),當(dāng)使用多奈哌齊或AChE si RNA抑制AChE表達(dá)后,以上指標(biāo)表達(dá)下調(diào)且最適劑量為10μM;(2)動(dòng)物實(shí)驗(yàn):TNF-α玻璃體腔注射后,AChE+/-+TNF-α組NF-кВ的入核量較AChE+/++TNF-α組少、而C57BL/6J小鼠模型中,Donepezil+TNF-α組NF-кВ的表達(dá)較Vehicle+TNF-α組少。結(jié)論:抑制AChE對(duì)視網(wǎng)膜炎癥的保護(hù)作用可能通過抑制NF-кВ經(jīng)典信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R774.1

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本文編號(hào)：1323079