本文關(guān)鍵詞：正常獼猴玻璃體腔注射人源黑視蛋白腺相關(guān)病毒表達(dá)及安全性研究

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【摘要】：目的:首先通過人源黑視蛋白腺相關(guān)病毒(p AAV2/8-CMV-h Mel-p2A-YFP)轉(zhuǎn)染離體培養(yǎng)的293T細(xì)胞、正常大鼠原代視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞、正常大鼠視網(wǎng)膜,驗證構(gòu)建的病毒載體轉(zhuǎn)染及表達(dá)性能。進(jìn)一步通過對獼猴行兩種術(shù)式(1.直接玻璃體腔注射;2.內(nèi)界膜剝除+玻璃體腔注射)病毒注射,觀察該病毒在靈長類動物體內(nèi)的轉(zhuǎn)染及表達(dá),并對比兩種術(shù)式對病毒表達(dá)的影響;探索正常獼猴視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞表達(dá)人源黑視蛋白的對光反應(yīng)功能;觀察手術(shù)方式及病毒在獼猴體內(nèi)轉(zhuǎn)染的安全性。為該光遺傳治療策略在治療人視網(wǎng)膜變性疾病提供理論基礎(chǔ)和實踐指導(dǎo)。方法:1.將構(gòu)建的共表達(dá)人源黑視蛋白及YFP熒光蛋白的腺相關(guān)病毒,通過體外轉(zhuǎn)染離體細(xì)胞(293T細(xì)胞系,正常大鼠原代視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞)及在體轉(zhuǎn)染正常大鼠視網(wǎng)膜觀察人源黑視蛋白及YFP的表達(dá),驗證該病毒的轉(zhuǎn)染、表達(dá)能力。2.將3只正常獼猴的6眼分為兩組,3只右眼為一組,行后段玻璃體切除+內(nèi)界膜剝除+C3F8氣體填充+玻璃體腔注射30μL構(gòu)建的腺相關(guān)病毒(病毒滴度9.71×1012v.p/mL);3只左眼為一組,直接玻璃體腔注射30μL病毒,注射病毒3個月后腹腔注射戊巴比妥鈉將獼猴安樂死,取下視網(wǎng)膜計數(shù)獼猴視網(wǎng)膜YFP陽性細(xì)胞,對比內(nèi)界膜剝除對病毒轉(zhuǎn)染效率的影響,并采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄YFP陽性細(xì)胞的對光反應(yīng)功能。3.術(shù)前及術(shù)后1月、2月、3月對獼猴行眼底照相、自發(fā)熒光、OCT等眼部形態(tài)學(xué)檢測;術(shù)前及術(shù)后3月對獼猴的FERG、FVEP指標(biāo)進(jìn)行檢測,并行統(tǒng)計學(xué)分析,觀察病毒的注射及手術(shù)的處理是否會引發(fā)嚴(yán)重的眼部并發(fā)癥。4.術(shù)前及術(shù)后3個月對獼猴外周血中炎癥因子、肝功能、腎功能等血液檢驗學(xué)指標(biāo)進(jìn)行檢測,并行統(tǒng)計學(xué)分析,研究我們所使用的腺相關(guān)病毒是否會引起正常獼猴全身嚴(yán)重的免疫、炎癥反應(yīng)。5.術(shù)后3個月腹腔注射戊巴比妥鈉將獼猴安樂死,對心臟、肝臟、腎臟等全身臟器行組織病理學(xué)觀察,研究我們所使用的腺相關(guān)病毒是否會引起基因突變,導(dǎo)致腫瘤等疾病的發(fā)生。結(jié)果:1.構(gòu)建的人源黑視蛋白腺相關(guān)病毒在體外細(xì)胞系(293T細(xì)胞系、原代神經(jīng)元)及正常嚙齒類動物(LE大鼠)視網(wǎng)膜均有較好的轉(zhuǎn)染力,可共表達(dá)人源黑視蛋白及YFP熒光蛋白。2.構(gòu)建的人源黑視蛋白腺相關(guān)病毒在正常獼猴視網(wǎng)膜有較好的轉(zhuǎn)染力,YFP熒光蛋白主要表達(dá)于節(jié)細(xì)胞,視網(wǎng)膜鋪片可見YFP陽性細(xì)胞的分布均為周邊高,中央低,內(nèi)界膜剝除眼和直接玻璃體腔注射眼之間未見統(tǒng)計學(xué)差異。3.全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄到470nm藍(lán)光刺激時,獼猴視網(wǎng)膜YFP陽性神經(jīng)節(jié)細(xì)胞能夠?qū)夥磻?yīng),產(chǎn)生內(nèi)向電流及動作電位。4.術(shù)前及術(shù)后1月、2月、3月眼底照相、眼底自發(fā)熒光、OCT等形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果表明:內(nèi)界膜剝除眼術(shù)后可見內(nèi)界膜剝除證據(jù),未見手術(shù)并發(fā)癥,眼部功能學(xué)檢測(FERG,FVEP)術(shù)前及術(shù)后3個月比較無統(tǒng)計學(xué)差異。5.血液檢驗學(xué)指標(biāo)結(jié)果表明:獼猴肝功能、腎功能、心肌酶譜、炎性因子等指標(biāo)術(shù)前及術(shù)后3月對比未見統(tǒng)計學(xué)差異。6.全身各臟器石蠟切片HE染色未見明顯病理學(xué)改變。結(jié)論:1.證實了構(gòu)建的人源黑視蛋白腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染及表達(dá)能力正常,可共表達(dá)人源黑視蛋白及YFP熒光蛋白。2.證明了在正常獼猴非感光視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞能夠通過光遺傳學(xué)技術(shù)表達(dá)人源黑視蛋白,獲得對光反應(yīng)功能。3.建立了獼猴后段玻璃體切除+內(nèi)界膜剝除+C3F8氣體填充+玻璃體腔注射病毒的手術(shù)方式,研究了正常獼猴玻璃體腔注射和內(nèi)界膜剝除+玻璃體腔注射兩種轉(zhuǎn)染方式對轉(zhuǎn)染率的影響,確定了直接玻璃體腔注射轉(zhuǎn)染的優(yōu)勢。4.證明了通過光遺傳學(xué)技術(shù)在靈長類動物視網(wǎng)膜表達(dá)人源黑視蛋白的安全性。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R774.1

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1 張W，

本文編號：1296426