本文關(guān)鍵詞：煙酸緩釋劑在大鼠糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療作用及機制探討

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【摘要】：目的:本實驗研究通過STZ誘導(dǎo)建立Wistar大鼠糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic Retinopathy,DR)模型并應(yīng)用煙酸緩釋劑干預(yù)治療,研究其對大鼠DR模型的治療作用,并探討其作用發(fā)生的機制。方法:(1)6-8周雄性成年Wistar大鼠150只,分為正常(CON)組(50只鼠)、糖尿病(DM)組(50只鼠)、煙酸(NA)干預(yù)組(50只鼠)。由大鼠的尾靜脈使用注射器注射STZ誘導(dǎo)糖尿病模型,治療組于造模第7天開始以煙酸(40mg/kg/day)連續(xù)灌胃治療,對照組正常喂食水。造模后第3個月摘除大鼠眼球行HE染色,進行病理評估;各組大鼠檢測體重、血糖、膽固醇以及HDL含量;EB血管灌注造影視網(wǎng)膜鋪片及伊文思藍滲漏量定量檢測BRB的破壞程度;TUNEL法檢測大鼠視網(wǎng)膜RGC細胞凋亡情況;免疫組化檢測Claudin-5、Occludin、VEGF/VEGFR、Tie-2、VCAM-1、TNF-α、CD45的表達情況;Western blot檢測VEGF/VEGFR、Ang-1/Tie-2、VCAM-1/ICAM-1、NF-κB/TNF-α、IL-6、i NOS、ZO-1的蛋白表達量;q RT-PCR檢測micro RNA-126(mi R-126)、Claudin-5、Occludin、ZO-1、ICAM-1、NF-κB、i NOS的m RNA相對表達量。(2)人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng),分為正常細胞(CON)組、高糖培養(yǎng)基(HI)組、高糖培養(yǎng)基+煙酸干預(yù)(NA)組、高糖培養(yǎng)基+煙酸干預(yù)+micro RNA-126抑制劑(NI)組。對照組普通ECM培養(yǎng)基培養(yǎng),其他3組高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。4組分別于培養(yǎng)8天后處理進行PCR和Western blot檢測,PCR檢測每組的micro RNA-126的表達量,Western blot檢測VEGF和Ang-1的蛋白表達量。結(jié)果:(1)干預(yù)三個月后DM組大鼠血糖平均量較CON組明顯升高,體重明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.45、25.01,P0.05);NA組血糖較DM組無明顯變化,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),體重平均量較DM組明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.93,P0.05)。DM組膽固醇平均量較CON組明顯增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.034,P0.05);NA組膽固醇平均量較DM組明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.868,P0.05);DM組HDL平均量較CON組明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.831,P0.05);NA組HDL平均量較DM組明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.369,P0.05)。CON組大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)排列清晰,細胞結(jié)構(gòu)完整、形態(tài)未見明顯異常;DM組大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)紊亂,細胞結(jié)構(gòu)異常,細胞核腫脹,可見出血和炎性細胞浸潤,一些血管明顯擴張;NA組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)排列整齊,未見出血和炎性細胞,細胞漸規(guī)則。DM組EB血管灌注視網(wǎng)膜鋪片與正常對照組大鼠相比,充盈EB的血管熒光外滲,DM組EB平均滲漏量較CON組明顯增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=24.712,P0.05);NA組較DM組EB外滲減少,NA組EB平均滲漏量較DM組明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=16.414,P0.05)。TUNEL檢測顯示DM組大鼠凋亡的視網(wǎng)膜細胞相對于CON組明顯增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=18.28,P0.05);NA組大鼠視網(wǎng)膜RGC凋亡細胞較DM組明顯減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.17,P0.05)。免疫組化結(jié)果顯示DM組VEGF/VEGFR、VCAM-1、TNF-α、CD45相對表達量較CON組明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=12.02、12.88、11.24、15.60、7.64,P0.05);NA組大鼠視網(wǎng)膜VEGF/VEGFR、VCAM-1、TNF-α、CD45相對表達量較DM組明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.44、11.58、7.49、8.83、3.82,P0.05)。DM組大鼠視網(wǎng)膜閉合蛋白(Occludin)和封閉蛋白(Claudin)-5相對表達量較CON組明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.36、13.05,P0.05);NA組大鼠視網(wǎng)膜Occludin和Claudin-5相對表達量較DM組明顯增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.62、7.30,P0.05)。NA組大鼠視網(wǎng)膜Tie-2相對表達量較DM組明顯增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.79,P0.05)。Western Blot結(jié)果示DM組大鼠視網(wǎng)膜VEGF/VEGFR、VCAM-1/ICAM-1、TNF-α/NF-κB、IL-6、i NOS的相對表達量較CON組明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.45、3.51、7.44、19.48、6.58、8.95、11.11、6.12,P0.05);NA組大鼠視網(wǎng)膜VEGF/VEGFR、VCAM-1/ICAM-1、TNF-α/NF-κB、IL-6、i NOS相對表達量較DM組明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.63、2.05、4.25、16.92、5.02、4.40、10.13、5.45,P0.05)。ZO-1蛋白的相對表達量較CON對照組大鼠明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=14.10,P0.05),NA組大鼠視網(wǎng)膜較DM組大鼠明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.77,P0.05)。Ang-1/Tie-2蛋白的相對表達量NA組大鼠視網(wǎng)膜較DM組大鼠明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.50、4.42,P0.05)。PCR結(jié)果顯示DM組大鼠視網(wǎng)膜緊密連接蛋白Occludin、Claudin-5、ZO-1相對表達量較CON組明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=11.422、12.638、12.060,P0.05);NA組大鼠視網(wǎng)膜Occludin、Claudin-5、ZO-1 m RNA相對表達量較DM組明顯增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.278、3.952、8.030,P0.05)。DM組大鼠視網(wǎng)膜ICAM-1、NF-κB、i NOS m RNA相對表達量較CON組明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=11.422、12.638、12.060,P0.05);NA組大鼠視網(wǎng)膜ICAM-1、NF-κB、i NOS m RNA相對表達量較DM組明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.278、3.952、8.030,P0.05)。DM模型組micro RNA-126的表達量較CON對照組降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=15.53,P0.05);NA組mi R-126相對表達量較DM模型組明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.18,P0.05)。(2)細胞光鏡結(jié)果顯示,CON組細胞生長狀態(tài)良好,呈梭形,貼壁牢固,細胞連接十分緊密,邊界完整清楚,呈單層“鋪路石”樣排列;HI和NI組細胞部分皺縮、變圓,細胞間隙增大,可見大量細胞脫落;NA組較HI組細胞生長狀態(tài)較好,呈梭形。PCR結(jié)果顯示,mi R-126表達量HI組較CON組明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=13.43,P0.05);NA組較HI組明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.62,P0.05);NI組較NA組明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.16,P0.05)。Western blot的結(jié)果顯示,HI組與CON對照組相比,VEGF表達量明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.54,P0.05);NA干預(yù)組與HI高糖組相比,VEGF表達量明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.76,P0.05);NI組與NA干預(yù)組相比,VEGF表達量明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.95,P0.05);NA干預(yù)組與HI高糖組相比,Ang-1表達量明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=16.25,P0.05);NI組與NA干預(yù)組相比,Ang-1表達量明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.24,P0.05)。結(jié)論:(1)大鼠尾靜脈注射STZ可成功誘導(dǎo)DR實驗?zāi)Ｐ?(2)煙酸緩釋劑能夠改善Wistar大鼠DR模型的組織病理學(xué)表現(xiàn)(3)煙酸緩釋劑具有修復(fù)血管作用,維持DR大鼠BRB完整性,煙酸的修復(fù)血管作用可能是通過micro RNA-126信號通路實現(xiàn)的。(4)煙酸具有抑制血管炎癥的作用,能夠調(diào)節(jié)炎癥因子的表達,其作用可能是通過NF-κB通路實現(xiàn)的。
【關(guān)鍵詞】：糖尿病視網(wǎng)膜病變 煙酸 血-視網(wǎng)膜屏障 microRNA-126 VEGF Ang-1 TNF-α NF-κB
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R587.2;R774.1
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-14
• 縮略語/符號說明14-16
• 前言16-19
• 研究現(xiàn)狀、成果17
• 研究目的、方法17-19
• 一、煙酸對于大鼠糖尿病視網(wǎng)膜病變的影響19-56
• 1.1 實驗動物、主要儀器與試劑19-24
• 1.1.1 實驗對象19
• 1.1.2 主要儀器19-20
• 1.1.3 主要試劑20-22
• 1.1.4 主要試劑配制22-24
• 1.2 實驗方法24-36
• 1.2.1 大鼠DM動物模型的建立24
• 1.2.2 成模后檢測、分組及藥物干預(yù)24
• 1.2.3 大鼠血液總膽固醇及HDL的檢測24
• 1.2.4 視網(wǎng)膜切片的HE染色24-25
• 1.2.5 視網(wǎng)膜免疫組織化學(xué)染色檢測Claudin-5、Occludin、VEGF、VEGFR、Tie-2、CD45、VCAM-1、TNF-α25-26
• 1.2.6 伊文思藍(EB)血管灌注造影視網(wǎng)膜鋪片26-27
• 1.2.7 視網(wǎng)膜組織伊文思藍(EB)滲漏量檢測27
• 1.2.8 視網(wǎng)膜TUNEL染色27-28
• 1.2.9 Western blot檢測VEGF、VEGFR、Ang-1、Tie-2、VCAM-1、ZO-1、IL-6、TNF-α、NF-κB、 ICAM-1、iNOS在視網(wǎng)膜組織的表達28-31
• 1.2.10 qRT-PCR 檢測緊密連接蛋白 Occludin、Claudin-5、ZO-1、NF-κB、ICAM-1、iNOS 在視網(wǎng)膜組織的表達31-34
• 1.2.11 qRT-PCR檢測miR-126在視網(wǎng)膜組織的表達34-36
• 1.3 統(tǒng)計學(xué)方法36
• 1.4 結(jié)果36-52
• 1.4.1 糖尿病動物模型的建立36
• 1.4.2 大鼠血糖及體重的情況36-37
• 1.4.3 各組大鼠總膽固醇以及HDL水平37-38
• 1.4.4 視網(wǎng)膜HE染色38-39
• 1.4.5 視網(wǎng)膜免疫組化檢測結(jié)果39-42
• 1.4.6 血管灌注造影視網(wǎng)膜鋪片結(jié)果42-43
• 1.4.7 視網(wǎng)膜伊文思藍(EB)滲漏量測定43-44
• 1.4.8 TUNEL染色視網(wǎng)膜細胞凋亡44-45
• 1.4.9 視網(wǎng)膜Western blot檢測結(jié)果45-50
• 1.4.10 視網(wǎng)膜qRT-PCR檢測結(jié)果50-52
• 1.5 討論52-55
• 1.6 小結(jié)55-56
• 二．煙酸對高糖HREC的作用56-69
• 2.1 實驗對象、主要儀器與試劑56-59
• 2.1.1 實驗對象56
• 2.1.2 實驗儀器56-57
• 2.1.3 實驗試劑57-58
• 2.1.4 主要試劑、液體的配制58-59
• 2.2 實驗方法59-64
• 2.2.1 HREC培養(yǎng)59
• 2.2.2 實驗分組59-60
• 2.2.3 qRT-PCR檢測miR-126在細胞的表達60-62
• 2.2.4 細胞Western blot檢測62-64
• 2.3 統(tǒng)計學(xué)方法64
• 2.4 結(jié)果64-67
• 2.4.1 HREC形態(tài)變化及生長狀況64-65
• 2.4.2 各組miR-126 的檢測65-66
• 2.4.3 細胞Western blot檢測結(jié)果66-67
• 2.5 討論67-68
• 2.6 小結(jié)68-69
• 全文結(jié)論69-70
• 論文創(chuàng)新點70-71
• 參考文獻71-74
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明74-75
• 綜述 MicroRNA在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的研究進展75-81
• 綜述參考文獻78-81
• 致謝81-82
• 個人簡歷82

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本文編號：1135037