本文關(guān)鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其培養(yǎng)上清液對小鼠角膜堿燒傷修復(fù)作用的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：目的:角膜堿燒傷是臨床上常見的致盲性眼外傷。目前對于該病主要的有藥物和手術(shù)兩種治療方法。這些治療方法雖然取得了一定的療效,但是在減輕堿燒傷后角膜混濁度,減輕角膜炎癥反應(yīng)和減少角膜新生血管方面的效果仍有待提高。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞因其較強(qiáng)的增殖能力和多向分化潛能,加之潛在的抗炎和抗新生血管作用,成為了組織損傷疾病細(xì)胞治療方法的理想種子細(xì)胞來源。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是否對于角膜堿燒傷具有一定的治療作用,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液是否也具有治療作用,目前國內(nèi)外對于其在小鼠角膜堿燒傷方面的研究較少。本實(shí)驗(yàn)建立并驗(yàn)證了一種穩(wěn)定可重復(fù)的小鼠角膜堿燒傷模型,并在此基礎(chǔ)上探討了應(yīng)用結(jié)膜下注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液點(diǎn)眼兩種治療方法對于角膜堿燒傷的治療效果。方法:1.利用浸潤于Na OH溶液的單層濾紙片貼附于小鼠角膜中央進(jìn)行角膜堿燒傷,通過造模后裂隙燈檢查眼表情況和HE染色檢查,比較不同濃度Na OH溶液和不同濾紙片貼附時(shí)間下角膜堿燒傷的作用效果,從而選擇一種相對穩(wěn)定性強(qiáng),一致性好的小鼠角膜堿燒傷動(dòng)物模型制作方法。2.獲得穩(wěn)定可重復(fù)的小鼠角膜堿燒傷模型后,將實(shí)驗(yàn)小鼠分為三組:分別是堿燒傷后給予球結(jié)膜下注射0.1ml含1×106個(gè)BMSCs的懸浮液的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療組;堿燒傷后每天給予6次骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液點(diǎn)眼組;以及堿燒傷后每天給予6次PBS液點(diǎn)眼組。結(jié)膜下注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組為堿燒傷造模后進(jìn)行注射,點(diǎn)眼組為每天6次點(diǎn)眼,直至處死小鼠。3.造模后裂隙燈觀察眼表情況變化:造模后早期第1天、第3天、第5天、第7天利用熒光素染色法觀察角膜上皮愈合情況;造模后第3天、第7天、第14天、第21天、第28天觀察角膜新生血管情況;造模后第3天、第7天、第14天、第21天、第28天進(jìn)行中央角膜混濁度評分,共觀察4周。4.造模后第3天、7天、14天和28天,通過HE染色法觀察角膜組織變化情況、炎癥反應(yīng)和新生血管生成情況,并對中央角膜的基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。5.造模后第28天,通過免疫組織化學(xué)染色法檢測角膜組織中Ki-67、α-SMA、MMP-9的表達(dá)。研究結(jié)果:1.利用浸潤于1mol/L Na OH溶液的單層濾紙片貼附于小鼠中央角膜10s,可建立深淺適度、可重復(fù)性強(qiáng)的小鼠角膜堿燒傷動(dòng)物模型。2.角膜堿燒傷后球結(jié)膜下注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和角膜堿燒傷后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液點(diǎn)眼,都具有促進(jìn)角膜上皮修復(fù)的作用。造模后1天、3天、5天、7天,應(yīng)用PBS點(diǎn)眼的對照組角膜上皮缺損面積大于另外兩個(gè)治療組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.角膜堿燒傷后球結(jié)膜下注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和角膜堿燒傷后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液點(diǎn)眼,兩種治療方法都在一定程度上具有減少角膜新生血管生成的作用。造模后3天、7天、14天、21天、28天,應(yīng)用PBS點(diǎn)眼的對照組新生血管面積大于另外兩個(gè)治療組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.角膜堿燒傷后球結(jié)膜下注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和角膜堿燒傷后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液點(diǎn)眼,兩種治療方法都具有改善角膜混濁程度的作用。造模后3天、7天、14天、21天、28天,應(yīng)用PBS點(diǎn)眼的對照組角膜混濁度評分大于另外兩個(gè)治療組。5.通過HE染色觀察顯示,與兩個(gè)治療組相比,PBS液點(diǎn)眼組角膜上皮愈合較慢,新生角膜上皮層數(shù)較少,基質(zhì)細(xì)胞排列較紊亂,炎性細(xì)胞浸潤和新生血管生成相對較多。而堿燒傷后28天兩個(gè)治療組角膜基質(zhì)層膠原排列較規(guī)則,無炎性細(xì)胞浸潤,新生血管較少。角膜基質(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示球結(jié)膜下注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液點(diǎn)眼組細(xì)胞數(shù)量低于PBS液點(diǎn)眼組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。6.免疫組織化學(xué)檢查顯示,PBS點(diǎn)眼組角膜基質(zhì)層的α-SMA和MMP-9表達(dá)陽性度較高,而該組在角膜上皮層基底細(xì)胞的Ki-67陽性度低于另外兩組。結(jié)論:結(jié)膜下注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液點(diǎn)眼兩種方法都對堿燒傷后的小鼠角膜具有修復(fù)作用。局部應(yīng)用的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和其培養(yǎng)上清液能夠改善堿燒傷后角膜透明度,促進(jìn)角膜上皮愈合并能夠相對抑制角膜新生血管的形成。
【關(guān)鍵詞】：角膜堿燒傷 基質(zhì)細(xì)胞 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液 新生血管 角膜混濁
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R772.2
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 縮略語/符號說明11-12
• 前言12-15
• 研究現(xiàn)狀、成果12-13
• 研究目的、方法13-15
• 一、小鼠角膜堿燒傷模型的建立方法和驗(yàn)證15-36
• 1.1 對象和方法15-21
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物15
• 1.1.2 試劑及耗材15-16
• 1.1.3 實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑及溶液的配制16-17
• 1.1.4 主要儀器設(shè)備17-18
• 1.1.5 實(shí)驗(yàn)方法18-21
• 1.1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法21
• 1.2 結(jié)果21-31
• 1.2.1 小鼠全身和眼部的一般情況21-22
• 1.2.2 小鼠角膜堿燒傷模型的建立22-30
• 1.2.3 小鼠角膜堿燒傷模型的驗(yàn)證30-31
• 1.3 討論31-35
• 1.3.1 角膜堿燒傷模型的選擇31-32
• 1.3.2 角膜堿燒傷的損傷機(jī)制32-35
• 1.4 小結(jié)35-36
• 二、結(jié)膜下注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液點(diǎn)眼對堿燒傷后小鼠角膜的影響36-66
• 2.1 對象和方法36-41
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物36
• 2.1.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液36
• 2.1.3 試劑及耗材36-38
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑及溶液的配制38
• 2.1.5 主要儀器設(shè)備38
• 2.1.6 實(shí)驗(yàn)方法38-41
• 2.1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法41
• 2.2 結(jié)果41-62
• 2.2.1 結(jié)膜下注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液點(diǎn)眼有助于角膜上皮愈合41-48
• 2.2.2 結(jié)膜下注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液點(diǎn)眼有助于堿燒傷后角膜新生血管的生成48-57
• 2.2.3 結(jié)膜下注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液點(diǎn)眼有助于減輕角膜堿燒傷后角膜混濁57-58
• 2.2.4 HE染色檢查角膜組織結(jié)構(gòu)變化58-61
• 2.2.5 免疫組織化學(xué)染色檢查角膜組織結(jié)構(gòu)變化61-62
• 2.3 討論62-65
• 2.3.1 間充質(zhì)干細(xì)胞的主要特征62-63
• 2.3.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對堿燒傷后早期角膜上皮愈合的影響63-64
• 2.3.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對堿燒傷后角膜炎癥反應(yīng)的影響64
• 2.3.4 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對堿燒傷后角膜新生血管的影響64-65
• 2.3.5 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用途徑65
• 2.4 小結(jié)65-66
• 結(jié)論66-67
• 參考文獻(xiàn)67-74
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明74-77
• 綜述 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在角膜損傷修復(fù)方面的研究進(jìn)展77-95
• 綜述參考文獻(xiàn)86-95
• 致謝95-96
• 個(gè)人簡歷96

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1106128