本文關(guān)鍵詞：M2巨噬細(xì)胞過繼免疫對(duì)脊髓損傷大鼠功能恢復(fù)的影響

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【摘要】：研究背景:脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI)后多種免疫細(xì)胞,如淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等可以浸入損傷局部微環(huán)境。有研究表明,巨噬細(xì)胞在SCI后的一系列變化中可能起到相當(dāng)重要的作用。SCI后,經(jīng)典活化的(Classically activated)促炎癥反應(yīng)M1型巨噬細(xì)胞和替代性活化的(Alternatively activated)抗炎癥反應(yīng)的M2型巨噬細(xì)胞在SCI微環(huán)境中高表達(dá)。M1細(xì)胞對(duì)SCI修復(fù)有神經(jīng)毒性,而M2巨噬細(xì)胞對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的再生有促進(jìn)作用;SCI后,M1巨噬細(xì)胞迅速增多且持續(xù)存在,但M2巨噬細(xì)胞反應(yīng)遲緩且持續(xù)時(shí)間短暫。因此,SCI后,通過提高M(jìn)2巨噬細(xì)胞的比例并延長它們在損傷局部微環(huán)境的停留時(shí)間,可能是治療SCI的很有希望的策略。目的:研究M2巨噬細(xì)胞過繼免疫對(duì)SCI的修復(fù)作用,并探討其機(jī)制,為SCI的治療尋找新策略。方法:(1)分離大鼠股骨骨髓,用條件培養(yǎng)基培養(yǎng)7天培養(yǎng)出巨噬細(xì)胞(M0),通過不同條件誘導(dǎo)分化得M1和M2巨噬細(xì)胞;(2)采用免疫熒光染色法和流式細(xì)胞術(shù)鑒定M0、M1和M2巨噬細(xì)胞的標(biāo)志及其純度;(3)采用ELISA法檢測M0、M1和M2細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6、NO、IL-10、TNF-αaa和TGF-β的表達(dá)水平。(4)采用紐約大學(xué)SCI儀制備重物墜落脊髓損傷SD大鼠模型,并于SCI后第7天過繼免疫CFSE標(biāo)記的M0、M1和M2巨噬細(xì)胞;(5)應(yīng)用熒光定量PCR法測定各實(shí)驗(yàn)組脊髓損傷中心處IL-4、IL-10、IL-13、IL-6、i NOS和TNF-γ的含量。(6)應(yīng)用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞過繼免疫1W后SCI中心及其周圍各實(shí)驗(yàn)組中M0、M1和M2巨噬細(xì)胞的分布和比例;(7)采用免疫組織熒光染色法觀察細(xì)胞過繼免疫1W后各實(shí)驗(yàn)組脊髓損傷中心及其周圍Th1和Th2細(xì)胞的分布與比例;(8)采用Basso Beattie Bresnahan(BBB)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分,腳印分析和網(wǎng)格行走實(shí)驗(yàn)觀察各實(shí)驗(yàn)組SCI大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況;(9)SCI后第6W處死大鼠,取脊髓組織做連續(xù)冰凍切片,應(yīng)用中性紅、快藍(lán)、甲苯胺藍(lán)染色法以及電鏡觀察各組殘留脊髓髓鞘化和神經(jīng)元存活情況。結(jié)果:(1)成功分離、培養(yǎng)出M0、M1和M2巨噬細(xì)胞,純度達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求;(2)ELISA法檢測M0、M1細(xì)胞上清中IL-6、TNF-α和NO的含量明顯高于M2巨噬細(xì)胞,M2巨噬細(xì)胞上清中IL-10、TGF-β含量明顯高于其他兩組;(3)細(xì)胞過繼免疫1W后,各組CD68+細(xì)胞數(shù)沒有差別,分別為1096±395、1462±548、1687±540和1585±560/mm2,但M2巨噬細(xì)胞過繼免疫組CD68+CCR7+細(xì)胞(即M1巨噬細(xì)胞)明顯少于其它3組,CD68+ARG1+細(xì)胞(即M2巨噬細(xì)胞)明顯高于其它3組,其它3組相差不大;(4)M2巨噬細(xì)胞過繼免疫有利于浸潤的單核巨噬細(xì)胞以及內(nèi)源性的小膠質(zhì)細(xì)胞向M2巨噬細(xì)胞方向極化,空白對(duì)照組、M0、M1和M2細(xì)胞過繼免疫組M2巨噬細(xì)胞分別為38±11、40±10、35±12和512±106/mm 2;(5)M2巨噬細(xì)胞過繼免疫有利于Th細(xì)胞向Th2細(xì)胞極化,空白對(duì)照組、M0、M1和M2細(xì)胞過繼免疫組Th2細(xì)胞分別為38±13、36±15、41±16和540±146/mm2;(6)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn),M2巨噬細(xì)胞過繼免疫組IFN-γ低表達(dá),IL-10、IL-13高表達(dá),與其它3組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,M1巨噬細(xì)胞組IL-6、TNF-α以及i NOS的m RNA表達(dá)量明顯高于其它3組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;(7)M2巨噬細(xì)胞過繼免疫能明顯提高SCI大鼠的運(yùn)動(dòng)功能,表現(xiàn)為M2巨噬細(xì)胞組大鼠的BBB評(píng)分明顯高于其它各組;腳印分析得分明顯高于其它各組;網(wǎng)格行走實(shí)驗(yàn)正確率也明顯高于其它各組,其它各組BBB評(píng)分、腳印分析和網(wǎng)格行走實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有差別;(8)M2巨噬細(xì)胞過繼免疫組脊髓缺損體積明顯小于其他組,有髓鞘的軸突更多以及前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活數(shù)量遠(yuǎn)高于其它3組;結(jié)論:SCI后,過繼免疫M(jìn)2巨噬細(xì)胞對(duì)脊髓組織有神經(jīng)保護(hù)作用,可以促進(jìn)大鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù),M2巨噬細(xì)胞通過產(chǎn)生抗炎癥細(xì)胞因子促進(jìn)Th細(xì)胞向Th2細(xì)胞方向極化,而Th2細(xì)胞通過分泌一些細(xì)胞因子等又可以進(jìn)一步促進(jìn)內(nèi)源性的小膠質(zhì)細(xì)胞或單核巨噬細(xì)胞向M2巨噬細(xì)胞極化。從而產(chǎn)生促進(jìn)組織損傷修復(fù)的良性循環(huán)效應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：脊髓損傷 M2巨噬細(xì)胞 過繼免疫 功能恢復(fù)
【學(xué)位授予單位】：蚌埠醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R651.2
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-10
• 前言10-12
• 1.實(shí)驗(yàn)材料與儀器12-14
• 2.實(shí)驗(yàn)方法14-28
• 3.結(jié)果28-41
• 4.討論41-44
• 5.結(jié)論44-45
• 參考文獻(xiàn)45-50
• 致謝50-51
• 附錄A 主要英文縮略詞51-52
• 附錄B 個(gè)人簡歷和發(fā)表論文52-53
• 附錄C 綜述53-61
• 參考文獻(xiàn)59-61

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本文編號(hào)：917205