發(fā)布時間：2017-09-25 11:59

  本文關鍵詞：M2巨噬細胞過繼免疫對脊髓損傷大鼠功能恢復的影響

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【摘要】：研究背景:脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI)后多種免疫細胞,如淋巴細胞、單核巨噬細胞等可以浸入損傷局部微環(huán)境。有研究表明,巨噬細胞在SCI后的一系列變化中可能起到相當重要的作用。SCI后,經典活化的(Classically activated)促炎癥反應M1型巨噬細胞和替代性活化的(Alternatively activated)抗炎癥反應的M2型巨噬細胞在SCI微環(huán)境中高表達。M1細胞對SCI修復有神經毒性,而M2巨噬細胞對神經細胞的再生有促進作用;SCI后,M1巨噬細胞迅速增多且持續(xù)存在,但M2巨噬細胞反應遲緩且持續(xù)時間短暫。因此,SCI后,通過提高M2巨噬細胞的比例并延長它們在損傷局部微環(huán)境的停留時間,可能是治療SCI的很有希望的策略。目的:研究M2巨噬細胞過繼免疫對SCI的修復作用,并探討其機制,為SCI的治療尋找新策略。方法:(1)分離大鼠股骨骨髓,用條件培養(yǎng)基培養(yǎng)7天培養(yǎng)出巨噬細胞(M0),通過不同條件誘導分化得M1和M2巨噬細胞;(2)采用免疫熒光染色法和流式細胞術鑒定M0、M1和M2巨噬細胞的標志及其純度;(3)采用ELISA法檢測M0、M1和M2細胞培養(yǎng)上清中IL-6、NO、IL-10、TNF-αaa和TGF-β的表達水平。(4)采用紐約大學SCI儀制備重物墜落脊髓損傷SD大鼠模型,并于SCI后第7天過繼免疫CFSE標記的M0、M1和M2巨噬細胞;(5)應用熒光定量PCR法測定各實驗組脊髓損傷中心處IL-4、IL-10、IL-13、IL-6、i NOS和TNF-γ的含量。(6)應用熒光顯微鏡和流式細胞術檢測細胞過繼免疫1W后SCI中心及其周圍各實驗組中M0、M1和M2巨噬細胞的分布和比例;(7)采用免疫組織熒光染色法觀察細胞過繼免疫1W后各實驗組脊髓損傷中心及其周圍Th1和Th2細胞的分布與比例;(8)采用Basso Beattie Bresnahan(BBB)運動功能評分,腳印分析和網格行走實驗觀察各實驗組SCI大鼠運動功能恢復情況;(9)SCI后第6W處死大鼠,取脊髓組織做連續(xù)冰凍切片,應用中性紅、快藍、甲苯胺藍染色法以及電鏡觀察各組殘留脊髓髓鞘化和神經元存活情況。結果:(1)成功分離、培養(yǎng)出M0、M1和M2巨噬細胞,純度達到實驗要求;(2)ELISA法檢測M0、M1細胞上清中IL-6、TNF-α和NO的含量明顯高于M2巨噬細胞,M2巨噬細胞上清中IL-10、TGF-β含量明顯高于其他兩組;(3)細胞過繼免疫1W后,各組CD68+細胞數(shù)沒有差別,分別為1096±395、1462±548、1687±540和1585±560/mm2,但M2巨噬細胞過繼免疫組CD68+CCR7+細胞(即M1巨噬細胞)明顯少于其它3組,CD68+ARG1+細胞(即M2巨噬細胞)明顯高于其它3組,其它3組相差不大;(4)M2巨噬細胞過繼免疫有利于浸潤的單核巨噬細胞以及內源性的小膠質細胞向M2巨噬細胞方向極化,空白對照組、M0、M1和M2細胞過繼免疫組M2巨噬細胞分別為38±11、40±10、35±12和512±106/mm 2;(5)M2巨噬細胞過繼免疫有利于Th細胞向Th2細胞極化,空白對照組、M0、M1和M2細胞過繼免疫組Th2細胞分別為38±13、36±15、41±16和540±146/mm2;(6)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn),M2巨噬細胞過繼免疫組IFN-γ低表達,IL-10、IL-13高表達,與其它3組比較有顯著統(tǒng)計學意義,M1巨噬細胞組IL-6、TNF-α以及i NOS的m RNA表達量明顯高于其它3組,有統(tǒng)計學意義;(7)M2巨噬細胞過繼免疫能明顯提高SCI大鼠的運動功能,表現(xiàn)為M2巨噬細胞組大鼠的BBB評分明顯高于其它各組;腳印分析得分明顯高于其它各組;網格行走實驗正確率也明顯高于其它各組,其它各組BBB評分、腳印分析和網格行走實驗結果統(tǒng)計學上沒有差別;(8)M2巨噬細胞過繼免疫組脊髓缺損體積明顯小于其他組,有髓鞘的軸突更多以及前角運動神經元存活數(shù)量遠高于其它3組;結論:SCI后,過繼免疫M2巨噬細胞對脊髓組織有神經保護作用,可以促進大鼠運動功能的恢復,M2巨噬細胞通過產生抗炎癥細胞因子促進Th細胞向Th2細胞方向極化,而Th2細胞通過分泌一些細胞因子等又可以進一步促進內源性的小膠質細胞或單核巨噬細胞向M2巨噬細胞極化。從而產生促進組織損傷修復的良性循環(huán)效應。
【關鍵詞】：脊髓損傷 M2巨噬細胞 過繼免疫 功能恢復
【學位授予單位】：蚌埠醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R651.2
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-10
• 前言10-12
• 1.實驗材料與儀器12-14
• 2.實驗方法14-28
• 3.結果28-41
• 4.討論41-44
• 5.結論44-45
• 參考文獻45-50
• 致謝50-51
• 附錄A 主要英文縮略詞51-52
• 附錄B 個人簡歷和發(fā)表論文52-53
• 附錄C 綜述53-61
• 參考文獻59-61

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本文編號：917205