本文關(guān)鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合Bio-oss修復(fù)兔顱骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：目的:基于兔顱骨缺損動(dòng)物模型,采用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)為種子細(xì)胞,Bio-oss為支架材料,復(fù)合培養(yǎng)植入兔顱骨缺損,對(duì)比觀察復(fù)合物組,Bio-oss組,BMSCs組,空白組成骨效果。觀察組織工程骨修復(fù)兔顱骨缺損的過程、效果,為骨組織工程(Bone tissue engineering,BTE)的臨床應(yīng)用提供參考。方法:分離培養(yǎng)雄性日本大耳兔BMSCs,將其作種子細(xì)胞,在雌性日本大耳兔顱骨采用一致的外直徑6mm的環(huán)形骨鉆制造全層骨缺損3個(gè)。共計(jì)32只雌性日本大耳兔,每組8只。將兔隨機(jī)分A、B、C、D四組,植入不同材料,A組:復(fù)合物組(植入Bio-oss復(fù)合BMSCs),B組:單純Bio-oss組(植入Bio-oss),C組:單純BMSCs組(植入BMSCs),D組:空白組。ABCD組表面均覆蓋引導(dǎo)組織再生(Guided tissue regeneration,GTR)膜。分別于2、4、8、12周四個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)處死,每組每個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)處死2只。標(biāo)本檢測(cè):大體觀察,X線檢測(cè),組織學(xué)及組織形態(tài)分析,A組及C組行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)檢測(cè)。結(jié)果:1.通過抽取雄性兔骨髓(bone mesenchymal,BM),經(jīng)密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選法可獲得BMSCs,流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)檢測(cè)BMSCs高表達(dá)CD44:96.8%,低表達(dá)CD45:0.8%。BMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)后向成骨細(xì)胞分化,細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變,體積逐漸增大,出現(xiàn)肥大梭形細(xì)胞及不規(guī)則多角形細(xì)胞,多角形細(xì)胞逐漸增多,未見明顯接觸抑制。細(xì)胞誘導(dǎo)三周后,甲苯胺藍(lán)染色見實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞出現(xiàn)藍(lán)黑色顆粒,有深藍(lán)色鈣化結(jié)節(jié)影,呈強(qiáng)陽(yáng)性,對(duì)照組弱陽(yáng)性。茜素紅染色,實(shí)驗(yàn)組見明顯紅色鈣結(jié)節(jié),對(duì)照組未見鈣結(jié)節(jié)。2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般情況:動(dòng)物無死亡,無活動(dòng)異常,切口處未見明顯紅腫、炎癥、感染。3.大體觀察見:AB組2、4、8、12周均可見Bio-oss顆粒,2、4、8周時(shí)較明顯,12周時(shí)仍可見Bio-oss顆粒,但較前三個(gè)時(shí)間點(diǎn)更少,2周及4周時(shí)質(zhì)中,周界清,缺損充填處表面粗糙顆粒狀。8周時(shí),質(zhì)較硬,周界較模糊(欠清晰),表面較光滑,12周時(shí),質(zhì)硬,周界模糊,表面較光滑。CD組可見新生組織向心性生長(zhǎng),2周及4周均見新生組織質(zhì)軟,周界較清晰,表面光滑,4周新生組織面積較2周增大。8周時(shí)C、D組新生組織質(zhì)中,周界模糊,表面光滑且稍凹陷,C組新生組織面積較4周增大,中央仍有少量缺損,12周時(shí)C組及D組已無組織缺損,新生組織質(zhì)稍硬,C組較D組稍硬,周界模糊,表面光滑稍凹陷。各組GTR膜均未見明顯移位,2周時(shí)可見GTR膜基本完整,4周時(shí)明顯較2周薄,8周時(shí)降解更加明顯,僅少部分存留,12周時(shí)已基本完全降解。4.X線檢查見:AB組4個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)均可見骨缺損處高密度阻射影,2周時(shí),邊界清晰,4周時(shí),顆粒感降低,邊界稍模糊,8周時(shí),材料與自體骨界限變模糊。12周時(shí),邊界較8周更加模糊不清,CD組可見骨缺損向心性融合生長(zhǎng),C組2、4、8、12周新生組織長(zhǎng)入分別約0.4mm、1mm、1.5mm、2.5mm,D組2、4、8、12周新生組織長(zhǎng)入分別約0.4mm、0.8mm,1mm,2mm,CD組2、4周時(shí)密度明顯低于自體骨,邊界較明顯,8周時(shí)密度稍低于自體骨,邊界較模糊,12周時(shí)密度稍低略自體骨,界限模糊。邊界較明顯。5.HE染色:缺損處觀察見,AB組受區(qū)Bio-oss不斷降解,膠原纖維增生,2周時(shí)材料周圍見明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),豐富的毛細(xì)血管,4周開始類骨質(zhì)明顯增多,8、12周骨質(zhì)不斷成熟、礦化,新生血管增多。CD組2周見大量膠原纖維增生,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),毛細(xì)血管豐富。4周少量類骨質(zhì)生成,少量新生血管,8、12骨質(zhì)不斷沉積、礦化。對(duì)新生骨面積統(tǒng)計(jì)結(jié)果示,按時(shí)間節(jié)點(diǎn)分組統(tǒng)計(jì),術(shù)后2周,ABCD組之間無明顯差異;術(shù)后4周,AB組優(yōu)于C組(P0.05)及D組(P0.05);術(shù)后8周,A組優(yōu)于B組(P0.05)及CD組(P0.05);術(shù)后12周;A組優(yōu)于CD組(P0.05)。按ABCD四組分組統(tǒng)計(jì),隨著時(shí)間的延長(zhǎng),新骨量逐漸增多,A組,4、8、12周均多于2周(4周2周:P0.05,8周2周:P0.01,12周2周:P0.01),8周多于4周(P0.05);B組,4、12周多于2周(P0.05);C組,8周多于2周(P0.05),12周多于2周,(P0.05);D組,8周多于2周(P0.05),12周多于2周(P0.05)。6.Masson染色:鑒定骨質(zhì)成熟程度,成熟骨紅染多。AB組術(shù)后2周受區(qū)見大量淡紅色Bio-oss顆粒,4周Bio-oss逐步被纖維結(jié)締組織分割,材料邊緣逐漸轉(zhuǎn)紅,8周Bio-oss進(jìn)一步降解,紅染漸增多,但排列紊亂,12周紅染區(qū)域進(jìn)一步擴(kuò)大且顏色逐漸加深。CD組術(shù)后2周大面積藍(lán)染,4周仍主要為藍(lán)染。8周開始出現(xiàn)較為明顯的紅染區(qū)域,多數(shù)仍為淡紅色,12周紅染區(qū)域進(jìn)一步擴(kuò)大。測(cè)量平均光密度值后統(tǒng)計(jì)示:按時(shí)間節(jié)點(diǎn),術(shù)后2周,ABCD組之間無顯著差異;術(shù)后4周,A組優(yōu)于C、D組(AC:P0.05;AD:P0.05);術(shù)后8周,A組優(yōu)于BCD組(AB:P0.05;AC:P0.05;AD:P≤0.01),B組優(yōu)于D組(P0.05);術(shù)后12周,A組優(yōu)于BCD組(AB:P0.05;AC:P0.05;AD:P0.05)。按ABCD四組分組統(tǒng)計(jì),隨著時(shí)間的延長(zhǎng),新生骨逐漸增多且逐步成熟礦化,A組,4、8、12周均高于2周(4周2周:P0.05,8周2周:P0.05,12周2周:P0.01),8、12周高于4周(8周:P0.05,12周:P0.05);B組,4、8、12周高于2周(4周:P0.05,8周:P0.01,12周:P0.01),8、12周高于4周(8周:P0.05,12周:P0.05),12周高于8周(P0.05);C組,4、8、12周均高于2周(4周:P=0.0170.05,8周:P=0.0020.01,12周:P=0.0020.01),8、12周高于4周(8周4周:P0.05,12周:P0.05);D組,4、8、12周均高于2周(4周:P=0.0230.05,8周:P≤0.01,12周2周:P0.01),8、12周高于4周(8周:P=0.0400.05,12周:P0.05)。結(jié)合大體觀察、X線檢測(cè)、HE及Masson染色結(jié)果,綜上所述,成骨效果A組較B、C、D組更佳,B組優(yōu)于CD組,CD組無明顯差異。對(duì)四組而言,隨時(shí)間延長(zhǎng),骨量逐漸增多,骨質(zhì)逐漸成熟。5.Y染色體檢測(cè):雄性兔的Y染色體性別決定基因(Sex-determining Region on the Y Chromosome,SRY)在四個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)的A組及C組均呈陽(yáng)性表達(dá)。結(jié)論:1.密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選法可提取到兔BMSCs,經(jīng)過培養(yǎng)、傳代可純化細(xì)胞。2.BMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)后向成骨細(xì)胞分化,可作為BTE理想的種子細(xì)胞。3.干細(xì)胞移植可選用SRY基因做示蹤。4.Bio-oss物理及化學(xué)性能與天然骨類似,生物相容性良好,可作為BTE良好的生物支架材料。5.以Bio-oss作為支架材料,BMSCs作為種子細(xì)胞復(fù)合植入兔顱骨有明顯的促進(jìn)成骨作用,為臨床骨缺損的治療提供了一個(gè)新的思路。
【關(guān)鍵詞】：BMSCs Bio-oss 兔顱骨 SRY BTE
【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R683;R318.08
【目錄】：

• 中文摘要3-8
• 英文摘要8-14
• 前言14-16
• 實(shí)驗(yàn)一 兔BMSCs的體外分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)成骨分化和材料與細(xì)胞復(fù)合的研究16-28
• 材料與方法16-20
• 結(jié)果20-23
• 討論23-27
• 結(jié)論27-28
• 實(shí)驗(yàn)二 兔BMSCs復(fù)合Bio-oss修復(fù)兔顱骨缺損28-52
• 材料與方法28-35
• 結(jié)果35-44
• 討論44-51
• 結(jié)論51-52
• 參考文獻(xiàn)52-59
• 英漢縮略詞對(duì)照表59-61
• 致謝61-63
• 骨組織替代材料用于口腔種植修復(fù)的研究進(jìn)展 綜述63-68

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