發(fā)布時(shí)間：2017-08-18 16:40

  本文關(guān)鍵詞：芍藥苷誘導(dǎo)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞自噬的發(fā)生

  更多相關(guān)文章： 增生性瘢痕 自噬 微管相關(guān)蛋白-輕鏈3 芍藥苷 基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-2

【摘要】：研究背景自噬是真核細(xì)胞中普遍存在的生命現(xiàn)象,自噬發(fā)生的重要特征為自噬體合成的增加,伴隨著LC3-I(微管相關(guān)蛋白-輕鏈3-I,microtubule-associated protein 1 light chain3-I)向LC3-II(微管相關(guān)蛋白-輕鏈3-II,microtubule-associated protein 1 light chain 3-II)的轉(zhuǎn)化的增加,因此,LC3-II/LC3-I的比值是評(píng)價(jià)自噬發(fā)生及自噬水平高低的一個(gè)重要指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)心臟、肺臟、腎臟等纖維化疾病中存在自噬不足現(xiàn)象,最近研究表明增生性瘢痕組織自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin1表達(dá)水平較正常皮膚組織明顯降低。增生性瘢痕病理特征主要表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞過度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)大量合成及沉積,然而增生性瘢痕中成纖維細(xì)胞的自噬水平尚不清楚。已有研究發(fā)現(xiàn)自噬的發(fā)生能抑制心、肺、腎等纖維化疾病的纖維化進(jìn)展,而自噬促進(jìn)劑能明顯抑制瘢痕成纖維細(xì)胞增殖、遷移,并明顯減少α-SMA的表達(dá)。芍藥苷(paeoniflorin,PAE)是傳統(tǒng)中藥芍藥的主要單體活性成分。本課題組前期研究表明芍藥苷能減少增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中TGF-β1的自分泌和α-SMA的表達(dá),從而抑制增生性瘢痕的發(fā)展,那么芍藥苷是否會(huì)影響增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的自噬發(fā)生?新近研究表明在瘢痕成纖維細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-2(tissue inhibitors of metalloproteinase-2,TIMP-2)的表達(dá)增加可引起I型膠原表達(dá)的下降,相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)在腎臟纖維化中TIMP-2表達(dá)的增加和自噬的發(fā)生存在正相關(guān)關(guān)系,而自噬促進(jìn)劑能有效減少瘢痕成纖維細(xì)胞中I型膠原的表達(dá)。本課題組前期研究表明芍藥苷能有效減少增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中I型膠原的分泌,那么芍藥苷能否調(diào)節(jié)TIMP-2的表達(dá)?是否能通過影響自噬的發(fā)生從而影響TIMP-2的表達(dá)?相關(guān)研究表明p38MAPK和ERK1/2與增生性瘢痕的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),那么p38MAPK和ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和芍藥苷影響成纖維細(xì)胞自噬的發(fā)生之間是否存在關(guān)聯(lián)?目的探討芍藥苷誘導(dǎo)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞自噬的發(fā)生方法(1)收集增生性瘢痕組織及正常皮膚組織,采用組織塊法分離培養(yǎng)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞和正常皮膚成纖維細(xì)胞,在不加任何刺激因素的情況下,Western Blot檢測(cè)兩種細(xì)胞中基礎(chǔ)條件下LC3和TIMP-2的表達(dá)情況;(2)分別加入不同濃度(0μmol/L、200μmol/L、400μmol/L、800μmol/L)的芍藥苷培養(yǎng)24h,Western Blot檢測(cè)兩種細(xì)胞中LC3、TIMP-2、p-p38MAPK、t-p38MAPK、p-ERK1/2和t-ERK1/2的表達(dá)情況;(3)加入400μmol/L的芍藥苷分別培養(yǎng)0h、2h、6h、12h、24h、48h,Western Blot檢測(cè)兩種細(xì)胞中LC3的表達(dá)情況;(4)加入400μmol/L芍藥苷,細(xì)胞培養(yǎng)24h,收集細(xì)胞,透射電鏡觀察細(xì)胞的自噬情況。結(jié)果(1)在不加任何刺激因素的情況下,增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中LC3-II/LC3-I的比值較正常成纖維細(xì)胞明顯降低(P0.01);(2)400μmol/L、800μmol/L的芍藥苷能增加增生性瘢痕和正常皮膚成纖維細(xì)胞中LC3-II/LC3-I的比值(P0.05),而對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞作用尤為顯著(P0.01);(3)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中LC3-II/LC3-I的比值呈時(shí)間依賴性增加,24h達(dá)高峰;(4)未加任何刺激因素的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中未見自噬體和自噬溶酶體,而400μmol/L芍藥苷處理細(xì)胞后,細(xì)胞胞漿內(nèi)可見明顯的自噬體和自噬溶酶體;(5)在不加任何刺激因素的情況下,增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中TIMP-2蛋白的表達(dá)量較正常皮膚成纖維細(xì)胞明顯升高;(6)增生性瘢痕和正常皮膚成纖維細(xì)胞中TIMP-2蛋白表達(dá)水平隨著芍藥苷濃度的增加呈濃度依賴性增加,其中400μmol/L、800μmol/L芍藥苷對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞影響顯著(P0.01);(7)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中p-p38MAPK、p-ERK1/2蛋白表達(dá)較正常皮膚成纖維細(xì)胞中升高,而增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中p-p38MAPK和p-ERK1/2蛋白表達(dá)在不同濃度芍藥苷刺激后均有升高。結(jié)論(1)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的自噬水平較正常成纖維細(xì)胞降低;(2)一定濃度的芍藥苷能誘導(dǎo)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞自噬的發(fā)生;(3)一定濃度的芍藥苷能增加增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中TIMP-2的表達(dá),而細(xì)胞自噬與TIMP-2高表達(dá)及膠原降解間的關(guān)系,需要進(jìn)一步研究;(4)一定濃度芍藥苷能增加增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中p-p38和p-ERK1/2蛋白表達(dá),而活化p38MAPK、ERK1/2與芍藥苷增加增生性成纖維細(xì)胞自噬的作用之間的關(guān)系及其作用機(jī)制,需要進(jìn)一步研究。
【關(guān)鍵詞】：增生性瘢痕 自噬 微管相關(guān)蛋白-輕鏈3 芍藥苷 基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-2
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R622
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-9
• 第一章 前言9-13
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料及方法13-24
• 1. 實(shí)驗(yàn)試劑、耗材及儀器13-18
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法18-23
• 3. 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析23-24
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果24-33
• 1. HSFb和NSF細(xì)胞形態(tài)的差異24
• 2. HSFb和NSFb自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)情況24-25
• 3. 芍藥苷對(duì)HSFb和NSFb中自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá)的影響25-28
• 4. 透射電鏡觀察增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的自噬情況28-29
• 5. HSFb和NSFb中TIMP-2 蛋白的表達(dá)情況29-30
• 6. 芍藥苷對(duì)HSFb和NSFb中TIMP-2 蛋白表達(dá)的影響30-31
• 7. 芍藥苷對(duì)HSFb和NSFb中p38MAPK和ERK1/2 蛋白表達(dá)的影響31-33
• 第四章 討論33-38
• 1. HSFb和NSFb的自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá)情況33-34
• 2. 芍藥苷對(duì)HSFb和NSFb中自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá)的影響34-35
• 3. 透射電鏡觀察增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的自噬情況35
• 4. 芍藥苷對(duì)HSFb和NSFb中TIMP-2 蛋白表達(dá)的影響35-36
• 5. 芍藥苷對(duì)HSFb和NSFb中中p38MAPK和ERK1/2 蛋白表達(dá)的影響36-38
• 第五章 結(jié)論38-39
• 參考文獻(xiàn)39-43
• 中英文縮略詞對(duì)照表43-44
• 攻讀碩士期間取得成果44-45
• 致謝45

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