本文關鍵詞：組織工程椎間盤構建及體內(nèi)生物學功能初步評價

  更多相關文章： 殼聚糖 PBST 組織工程 纖維環(huán) 髓核 支架

【摘要】：目的:模擬椎間盤組織結(jié)構和功能,構建具有生物學活性的組織工程椎間盤,初步評價其在體內(nèi)的生物學功能。方法:(1)取3周齡新西蘭大白兔椎間盤組織,利用Ⅱ型膠原酶消化法分別獲取髓核細胞和纖維環(huán)細胞,觀察鑒定第二代(P2)細胞。(2)利用交聯(lián)反應制備的殼聚糖水凝膠作為髓核支架,利用靜電紡絲技術制備的聚對苯二甲酸-共-丁二酸丁二醇酯[poly(butylene succinate-co-terephthalate),PBST]紡絲薄膜作為內(nèi)纖維環(huán)支架,以實心的PBST環(huán)作為外纖維環(huán)支架。采用掃描電鏡表征殼聚糖水凝膠和PBST紡絲薄膜的空間結(jié)構,測試PBST紡絲薄膜的孔隙率及吸水率。(3)在殼聚糖水凝膠、PBST紡絲薄膜上分別接種髓核細胞和纖維環(huán)細胞,培養(yǎng)3W后,HE染色檢測支架的細胞相容性。(4)以殼聚糖水凝膠作為髓核支架,PBST紡絲薄膜作為內(nèi)纖維環(huán)支架,實心的PBST環(huán)作為外纖維環(huán)支架,組裝成PBST/殼聚糖水凝膠三相組織工程椎間盤支架,檢測三相組織工程椎間盤支架的力學性能。(5)將P2代纖維環(huán)細胞、髓核細胞分別接種在纖維環(huán)、髓核支架上,再移至裸鼠皮下培養(yǎng);4W后,通過HE、番紅-O、CollagenⅡ免疫組化、Aggrecan免疫熒光染色觀察組織工程椎間盤的形態(tài)結(jié)構和II型膠原蛋白、蛋白聚糖的表達。(6)用上述裸鼠皮下培養(yǎng)的組織工程椎間盤置換3月齡新西蘭大白兔的椎間盤,鋼板固定相鄰椎體。術后4W行X線、MRI檢測并獲取組織工程椎間盤標本,通過HE、番紅-O、CollagenⅡ免疫組化、Aggrecan免疫熒光染色觀察組織工程椎間盤的形態(tài)結(jié)構和II型膠原蛋白、蛋白聚糖的表達。(7)提取裸鼠皮下組織工程椎間盤(裸鼠組)、實驗兔體內(nèi)組織工程椎間盤(實驗兔組)、兔正常椎間盤(對照組)的RNA,體外擴增CollagenⅡ、Aggrecan基因,RT-PCR檢測II型膠原蛋白及蛋白聚糖的表達。結(jié)果:(1)體外培養(yǎng)的P2代纖維環(huán)細胞、髓核細胞在形態(tài)上呈長梭形或多邊形,生長速度快。兩種細胞的番紅-O、CollagenⅡ免疫組化、Aggrecan(蛋白聚糖)免疫熒光染色均呈陽性,表明細胞分泌Ⅱ型膠原、蛋白聚糖。(2)殼聚糖水凝膠呈白色海綿狀,吸水后呈透明膠凍狀,掃描電鏡見支架存在大量孔隙,孔隙之間相互連通。接種髓核細胞體外培養(yǎng)3W后,HE染色可見細胞在支架內(nèi)生長良好,細胞分布均勻。(3)光鏡下見PBST纖維粗細均勻,無珠狀體形成;PBST紡絲薄膜呈白色,較疏松,孔隙率為61.83%±7.33%,吸水率為297.34%±57.13%;復合纖維環(huán)細胞體外培養(yǎng)3W后的PBST紡絲薄膜HE染色可見纖維環(huán)細胞在PBST紡絲薄膜內(nèi)分布均勻,細胞大量增殖。(4)組裝的三相組織工程椎間盤支架大小約9×5×2 mm,各相之間連接緊密,無明顯縫隙;壓縮強度為3.10MPa±0.13MPa,彈性模量為22.22 Mpa±0.92Mpa;拉伸強度為3.21MPa±0.18MPa,彈性模量為18.13MPa±1.30MPa。(5)裸鼠皮下構建的組織工程椎間盤具有與正常椎間盤相似的結(jié)構,各相之間融合良好,種子細胞在組織工程椎間盤內(nèi)分泌Ⅱ型膠原和蛋白聚糖。(6)X線檢測見鋼板內(nèi)固定位置良好,無斷裂、移位,椎間隙高度正常;MRI檢測見組織工程椎間盤T2相為高信號。(7)術后4W解剖實驗兔,組織工程椎間盤在椎間隙位置良好,形態(tài)完整,無移位、碎裂;組織工程椎間盤的HE染色見大量細胞,番紅-O、CollagenⅡ免疫組化、Aggrecan免疫熒光染色陽性,表明組織工程椎間盤含有Ⅱ型膠原和蛋白聚糖。(8)RT-PCR:CollagenⅡm RNA的表達:對照組高于實驗兔組,P=0.001,差異具有統(tǒng)計學意義;對照組高于裸鼠組,P=0.000,差異具有統(tǒng)計學意義。Aggrecan m RNA的表達:對照組高于實驗兔組,P=0.000,差異具有統(tǒng)計學意義;對照組高于裸鼠組,P=0.000,差異具有統(tǒng)計學意義;裸鼠組高于實驗兔組,P=0.000,差異具有統(tǒng)計學意義。結(jié)論:(1)PBST/殼聚糖三相組織工程椎間盤支架材料符合正常椎間盤的結(jié)構特點,具有良好的細胞相容性、孔隙率、力學性能和可塑性。(2)在裸鼠皮下構建的組織工程椎間盤各相之間融合良好,形態(tài)學觀察、組織結(jié)構特點與正常椎間盤相似,具有細胞生物活性。(3)采用鋼板固定相鄰上下椎體的固定方式可靠。組織工程椎間盤在體內(nèi)繼續(xù)保持細胞活性,分泌椎間盤細胞外基質(zhì),部分發(fā)揮椎間盤的生物學功能。(4)本實驗可為組織工程椎間盤構建提供理論依據(jù)。
【關鍵詞】：殼聚糖 PBST 組織工程 纖維環(huán) 髓核 支架
【學位授予單位】：西南醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R318.08;R681.5
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-13
• 前言13-16
• 第一部分 組織工程椎間盤種子細胞的培養(yǎng)鑒定和支架材料的制備表征16-38
• 材料與方法16-26
• 結(jié)果26-31
• 討論31-37
• 小結(jié)37-38
• 第二部分 組織工程椎間盤構建及體內(nèi)生物學功能初步評價38-59
• 材料與方法38-44
• 結(jié)果44-51
• 討論51-58
• 小結(jié)58-59
• 全文結(jié)論59-60
• 參考文獻60-70
• 英漢縮略詞對照表70-72
• 致謝72-73
• 綜述73-92
• 參考文獻85-92
• 研究生期間發(fā)表論文情況92-93

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本文編號：606658