本文關(guān)鍵詞：三碘甲狀腺原氨酸減輕七氟醚神經(jīng)毒性的機(jī)制研究

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【摘要】：研究背景：七氟醚是臨床麻醉中常用的一種吸入性麻醉藥,因起效迅速,可控性好,氣道刺激性小等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于小兒麻醉。最近的研究表明常用的吸入全麻藥暴露對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)均有不同程度的毒害作用,主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能的下降。處于發(fā)育期和退行性改變期的中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)全麻藥的毒性尤為敏感。處于發(fā)育期的兒童暴露于吸入麻醉藥后,在其成長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)行為改變及精神癥狀,一項(xiàng)臨床回顧性研究表明小于四歲的小兒暴露于麻醉和手術(shù)會(huì)增加他們發(fā)育中的閱讀、寫(xiě)作和數(shù)學(xué)計(jì)算能力障礙的風(fēng)險(xiǎn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也表明長(zhǎng)時(shí)間高濃度吸入七氟醚損害發(fā)育中的腦細(xì)胞,還可能導(dǎo)致遠(yuǎn)期的神經(jīng)認(rèn)知功能障礙。在老年患者,術(shù)后認(rèn)知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction, POCD)的發(fā)生率顯著高于實(shí)施同類(lèi)手術(shù)麻醉的青壯年患者,且研究表明,吸入麻醉藥暴露可加重中樞神經(jīng)退行性改變,致原有認(rèn)知功能障礙加重。最近的統(tǒng)計(jì)表明,美國(guó)每年約有數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的患兒需要手術(shù)和麻醉,如何防治吸入性全麻藥物如七氟醚對(duì)于發(fā)育期大腦的神經(jīng)毒性作用,已經(jīng)成為近年來(lái)眾多臨床醫(yī)生和科學(xué)工作者共同探討的話題之一。目前由于七氟醚等全麻藥物的作用機(jī)理及其對(duì)發(fā)育期大腦的神經(jīng)毒性未能完全闡明,大部分的研究都是集中在臨床前的動(dòng)物水平。加之臨床研究的可行性難度較大,所以對(duì)于全麻藥物中樞神經(jīng)毒性防治的研究還處于探索的初步階段。而且大多是來(lái)自體外的非生理性激素或藥物,防治效果也并不確切。甲狀腺激素(TH)是人和動(dòng)物正常生長(zhǎng)發(fā)育必需的一類(lèi)激素,在大腦的發(fā)育、分化、功能的維持中起著重要作用,可激活mTOR等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,影響基因轉(zhuǎn)錄與蛋白質(zhì)翻譯,調(diào)控神經(jīng)元增殖、突觸的發(fā)育成熟,改善學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能。在新生時(shí)期,也是大腦發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期。麻醉劑及其代謝產(chǎn)物可能對(duì)甲狀腺的功能狀態(tài)產(chǎn)生影響,干擾甲狀腺激素的分泌。本實(shí)驗(yàn)擬觀察TH對(duì)七氟醚麻醉后新生大鼠成年后認(rèn)知功能的影響及大腦海馬的神經(jīng)元顯微結(jié)構(gòu)、突觸后密度蛋白-95(PSD-95)、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體亞基2A與2B (NR2A/NR2B)表達(dá)的變化,從認(rèn)知功能障礙相關(guān)機(jī)制的角度探討七氟醚中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性的發(fā)生及防治機(jī)制,為全麻藥物神經(jīng)毒性的防治提供新的思路。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模和ㄟ^(guò)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(OFT)、糖水偏好實(shí)驗(yàn)(SPT)、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)(EPMT)、水迷宮實(shí)驗(yàn)(WMT)等行為學(xué)實(shí)驗(yàn),觀察新生大鼠七氟醚麻醉及T3干預(yù)后成年期大鼠認(rèn)知功能和情緒的改變；通過(guò)原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)觀察大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡情況；通過(guò)Nissl染色方法觀察海馬CA1及CA3區(qū)神經(jīng)元的密度；應(yīng)用溴脫氧嘧啶(BrdU)標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記大鼠海馬齒狀回(DG)區(qū)新增殖細(xì)胞以觀察神經(jīng)元增殖情況；應(yīng)用高爾基銀染色技術(shù)觀察大鼠成年時(shí)期海馬區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)改變；Western Blot檢測(cè)大鼠海馬區(qū)NMDA受體亞基NR2A、NR2B及其錨定蛋白PSD-95的表達(dá)；研究和探討圍麻醉期三碘甲狀腺原氨酸(T3)的使用能否減輕七氟醚對(duì)新生大鼠大腦的神經(jīng)毒性作用及其機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法：雌性SD大鼠處鼠5只,體重約180～220 g,成年雄性SD大鼠2只,雌鼠成功交配后自然分娩,待新生鼠出生后7 d(P7)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每只母鼠的子鼠隨機(jī)分為生理鹽水(NS)組,七氟醚(SEV)組和T3組,組內(nèi)雌雄各半。NS組腹腔注射5 ml/kg生理鹽水(與T3組等體積／體重比),SEV組于麻醉前0.5 h腹腔注射5 ml/kg生理鹽水,T3組麻醉前0.5 h腹腔注射T3 100 μg/kg,每組均連續(xù)注射3d,每次間隔24 h。首次給藥0.5 h后將SEV組和T3組新生鼠放入自制的22 cm×13cm×12 cm透明有機(jī)玻璃箱內(nèi),箱底鋪鈉石灰,箱內(nèi)持續(xù)給予1 L/min流量的七氟醚與空氣的混合氣體,出口處連接麻醉氣體監(jiān)測(cè)儀確保箱內(nèi)七氟醚的濃度維持在2%左右,持續(xù)麻醉6h后結(jié)束。NS組同樣的裝置給予1 L/min流量的空氣6 h。整個(gè)箱子放在恒溫板上,溫度37.0～38.0℃。且監(jiān)測(cè)新生鼠呼吸、皮膚及口唇黏膜顏色,整個(gè)過(guò)程無(wú)呼吸抑制等異常情況發(fā)生。待麻醉結(jié)束后6h各組隨機(jī)取3只新生鼠,斷頭取腦后制備石蠟切片,后行TUNEL染色計(jì)算DG區(qū)和SVZ區(qū)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞密度。另麻醉結(jié)束后當(dāng)天每組隨機(jī)取5只新生鼠腹腔注射BrdU (50 mg/kg),連續(xù)注射7d后斷頭取腦行免疫熒光染色計(jì)算DG區(qū)BrdU與DCX、GFAP雙標(biāo)個(gè)數(shù)與BrdU單標(biāo)的比例。余飼養(yǎng)至21d時(shí)斷奶,繼續(xù)飼養(yǎng)至25 d進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。將各組大鼠隨機(jī)分為兩批,第一批進(jìn)行WMT和EPMT。第二批進(jìn)行OFT和SPT。第一批大鼠,每組隨機(jī)取13只大鼠進(jìn)行連續(xù)3天WMT,休息1天后進(jìn)行EPMT。第二批大鼠從P25開(kāi)始進(jìn)行連續(xù)3天OFT, P28開(kāi)始連續(xù)三天進(jìn)行SPT。行為學(xué)結(jié)束后,每組隨機(jī)取5只大鼠(1-2只／母鼠)過(guò)量麻醉處死,取大腦組織固定后制備冰凍切片行Nissl染色觀察海馬CAl及CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞密度；每組隨機(jī)取3只大鼠過(guò)量麻醉后,快速取大腦行高爾基銀染色,分別觀察海馬CA1、CA3區(qū)錐體細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)(樹(shù)突分支數(shù)目、樹(shù)突總長(zhǎng)度以及空間分布)：在麻醉結(jié)束后6h (P7)、P15、P30,各組隨機(jī)取5只(1只／母鼠)大鼠的腦組織在冰面上快速分離,獲得海馬區(qū)組織行Western Blot檢測(cè)NR2A、NR2B,及其錨定蛋白PSD-95蛋白表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1.所有七氟醚吸入麻醉的新生鼠麻醉及蘇醒過(guò)程平穩(wěn),無(wú)呼吸抑制等異常情況出現(xiàn),給藥后的9天內(nèi),體重變化趨勢(shì)組間無(wú)顯著性差異(P0.05)。SEV組和T3組各有一只體重偏低的子鼠(分別為21 g,23 g)不再參與后繼的實(shí)驗(yàn)。2.麻醉結(jié)束后6h,與NS組相比較,SEV組DG區(qū)、SVZ區(qū)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞密度均顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.01及P0.05),而T3組與NS組比較,DG區(qū)和SVZ區(qū)的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞密度均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。P15時(shí),SEV組子鼠DG區(qū)BrdU/DCX、BrdU/GFAP雙標(biāo)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目與BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目的比值均低于對(duì)照組(P0.05),T3組BrdU/GFAP雙標(biāo)細(xì)胞個(gè)數(shù)與BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目的比值高于SEV組(P0.05),T3組與NS組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。七氟醚可減少大腦中神經(jīng)干細(xì)胞的增殖,而T3可以降低七氟醚對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響。3. P25-P30, SEV組大鼠表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力的減退,以及一定程度的抑郁和焦慮樣情緒改變,與SEV組比較,T3組大鼠的焦慮和抑郁樣情緒以及學(xué)習(xí)能力均有明顯改善。具體表現(xiàn)為：和NS及T3組相比,SEV組大鼠水迷宮的逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)(P0.01及P0.05),NS組和T3組相比較逃避潛伏期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；在SPT中,SEV組糖水飲用率較NS組顯著降低(P0.01),而T3組與NS組糖水飲用率相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。P25-P27時(shí),OFT中,SEV組大鼠在中央格區(qū)的停留時(shí)間較其他兩組顯著延長(zhǎng)(P0.05),T3組在中央格區(qū)的停留時(shí)間與NS組比較,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。P30時(shí),EPMT中,三組大鼠在開(kāi)放臂(open arms)停留的時(shí)間,組間比較均無(wú)顯著性差異(P0.05)。這些行為學(xué)結(jié)果表明,新生鼠七氟醚麻醉可致其成年期的學(xué)習(xí)記憶功能損害,并在一定程度上有焦慮和抑郁樣復(fù)雜情緒表現(xiàn),T3在圍麻醉期的應(yīng)用可以改善七氟醚對(duì)新生大鼠成年期學(xué)習(xí)記憶能力的損害和情緒的影響。4.P30時(shí),SEV組在CA3區(qū)細(xì)胞密度顯著低于NS組及T3組(P0.01),NS組及T3組相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；而CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞密度,三組間比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。P30時(shí),SEV組和T3組海馬CA3區(qū)錐體神經(jīng)元樹(shù)突總長(zhǎng)度均顯著短于NS組(P0.001,P0.05),且SEV組在CA3區(qū)的錐體神經(jīng)元樹(shù)突分支數(shù)目較對(duì)照組顯著減少(P0.01),而T3組與NS組樹(shù)突分支數(shù)比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；在CA1區(qū),SEV組錐體神經(jīng)元的樹(shù)突總長(zhǎng)度較NS組顯著減少(P0.05),T3組與NS組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),但CA1區(qū)錐體神經(jīng)元樹(shù)突分支數(shù)目,三組間比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。該數(shù)據(jù)表明,七氟醚對(duì)新生大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元的發(fā)育有損害作用,可導(dǎo)致CA1和CA3區(qū)錐體神經(jīng)元不同程度的發(fā)育障礙,而T3在圍麻醉期的使用可以減輕其對(duì)海馬錐體神經(jīng)元的毒性作用。5.P15時(shí),和NS組大鼠相比,SEV組PSD95、NR2B、NR2A的表達(dá)均顯著下降(P0.05),T3組這三種蛋白的表達(dá)高于SEV組(P0.05)。結(jié)果說(shuō)明新生鼠七氟醚麻醉可導(dǎo)致NMDA受體亞基表達(dá)紊亂,從而導(dǎo)致其錨定蛋白PSD-95表達(dá)下調(diào),使神經(jīng)元突觸的生長(zhǎng)發(fā)生異常。T3可以減輕七氟醚對(duì)發(fā)育期大腦神經(jīng)發(fā)育相關(guān)蛋白的干擾。實(shí)驗(yàn)結(jié)論：幼鼠在新生時(shí)期,七氟醚麻醉可導(dǎo)致中樞神經(jīng)損傷,出現(xiàn)海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡增多,影響海馬DG區(qū)的細(xì)胞增殖,主要是新生的未成熟神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖；大鼠成年期海馬CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞減少,CA1及CA3區(qū)錐體神經(jīng)元發(fā)育障礙；成年后的神經(jīng)行為學(xué)出現(xiàn)異常,表現(xiàn)為焦慮和抑郁的復(fù)雜情緒表現(xiàn)及學(xué)習(xí)記憶能力損害。圍麻醉期T3的使用可以減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡,減輕成年期海馬CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的缺失,改善錐體神經(jīng)元的發(fā)育。其機(jī)制可能與T3改善麻醉期間大腦細(xì)胞的能量代謝,使凋亡細(xì)胞減少,促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖以及調(diào)節(jié)NMDA受體亞基NR2A/NR2B的水平,增加其錨定蛋白PDS-95的表達(dá),改善海馬神經(jīng)元發(fā)育有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：七氟醚 神經(jīng)毒性 三碘甲腺原氨酸 發(fā)育 認(rèn)知功能
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R614
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 前言16-26
• 1 嬰幼兒(人和動(dòng)物)大腦發(fā)育的特點(diǎn)16-17
• 2 全麻藥物的神經(jīng)毒性及機(jī)理17-21
• 3 甲狀腺激素對(duì)大腦生長(zhǎng)發(fā)育的作用及機(jī)理21-22
• 4 麻藥毒性防治的研究現(xiàn)狀22-23
• 5 甲狀腺素在神經(jīng)發(fā)育及認(rèn)知功能障礙疾病方面的研究現(xiàn)狀23-24
• 6 麻醉對(duì)甲狀腺激素分泌水平的影響24
• 7 甲狀腺激素有可能改善七氟醚等全麻藥物引起的認(rèn)知功能障礙24-26
• 實(shí)驗(yàn)材料26-31
• 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物26
• 2 主要實(shí)驗(yàn)試劑26-27
• 3 主要實(shí)驗(yàn)儀器27-28
• 4 實(shí)驗(yàn)溶液配制28-31
• 實(shí)驗(yàn)方法31-46
• 1 交配與飼養(yǎng)31
• 2 分組與模型建立31-33
• 3 記錄三組大鼠體重變化33
• 4 腦組織石蠟切片及冰凍制備33-34
• 5 TUNEL染色34-35
• 6 BrdU標(biāo)記35-36
• 7 行為學(xué)檢測(cè)36-38
• 8 Nissl染色38-39
• 9 高爾基銀浸染色39-40
• 10 免疫熒光染色檢測(cè)BrdU與DCX、GFAP雙標(biāo)的比例40-41
• 11 Western Blot(免疫印跡)41-45
• 12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析45-46
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果46-60
• 1 七氟醚麻醉及圍麻醉期T3的應(yīng)用不影響新生大鼠體重變化46-47
• 2 T3改善七氟醚麻醉所致的認(rèn)知功能損害47-51
• 3 三碘甲腺原氨酸減少七氟醚誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡51-52
• 4 T3可部分改善七氟醚麻醉導(dǎo)致的新生鼠海馬區(qū)神經(jīng)元的增殖52-54
• 5 T3可逆轉(zhuǎn)七氟醚麻醉導(dǎo)致的新生鼠成年后CA3區(qū)神經(jīng)元丟失54-55
• 6 高爾基染色顯示七氟醚組大鼠海馬椎體神經(jīng)元發(fā)育異常55-58
• 7 T3減輕七氟醚麻醉導(dǎo)致的幼年大鼠海馬中NMDA受體亞基表達(dá)紊亂和PSD-95下調(diào)表達(dá)58-60
• 實(shí)驗(yàn)討論60-64
• 參考文獻(xiàn)64-70
• 結(jié)論70-71
• 英文縮略詞表71-72
• 在校期間發(fā)表的論文72-73
• 致謝73-74

【相似文獻(xiàn)】

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8 曹t熎，

本文編號(hào)：604357