發(fā)布時(shí)間：2017-06-06 19:03

  本文關(guān)鍵詞：GATA4招募PCG蛋白介導(dǎo)miR-29a表達(dá)調(diào)控C2C12細(xì)胞增殖與分化的機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景與目的橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma,RMS)是起源于骨骼肌的惡性腫瘤,也是兒童期最常見(jiàn)的軟組織腫瘤,肌祖細(xì)胞增殖和分化失衡是其發(fā)生的主要原因,但相關(guān)分子機(jī)制,目前知之甚少,因此,闡明肌祖細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控機(jī)制,對(duì)于揭示橫紋肌肉瘤的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。GATA家族是具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子,能夠結(jié)合靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的WGATAA序列,從而調(diào)控基因的表達(dá),其家族成員GATA4在調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞C2C12的增殖和分化中起著重要作用,但在橫紋肌肉瘤發(fā)生中的機(jī)制,目前尚未闡明。Polycomb復(fù)合體是一組抑制基因轉(zhuǎn)錄的蛋白,其復(fù)合體成員EZH2可通過(guò)對(duì)GATA4蛋白第299位賴氨酸甲基化從而抑制GATA4的轉(zhuǎn)錄活性。但二者在橫紋肌肉瘤發(fā)生中的機(jī)制,目前尚未闡明。研究表明,micro RNA調(diào)節(jié)異常也與橫紋肌肉瘤存在密切關(guān)系。micro RNA異常如肌肉特異性micro RNA(miR-1、miR-133a/b、miR-206)和miR-29家族異常,都會(huì)誘發(fā)橫紋肌肉瘤的發(fā)生,但其精確機(jī)制,還有待于進(jìn)一步闡明。本研究發(fā)現(xiàn)GATA4與EZH2通過(guò)調(diào)控miR-29a的表達(dá),從而調(diào)控成肌細(xì)胞C2C12的增殖和分化,并在橫紋肌肉瘤的發(fā)生中發(fā)揮作用。因此本課題旨在揭示C2C12的增殖和分化及橫紋肌肉瘤發(fā)生的分子機(jī)制,以期為其治療和預(yù)后評(píng)估提供理論依據(jù)。研究方法1.生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè),cyclin D2是miR-29a的下游靶基因,本研究中我們采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、MTT法、流式細(xì)胞分析、DAPI染色、熒光素酶報(bào)告基因、QPCR及Westem Blot實(shí)驗(yàn)來(lái)研究miR-29a靶向cyclin D2,對(duì)細(xì)胞增殖、周期和凋亡的影響。2.本研究中,我們采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、QPCR、Westem Blotting、CO-IP和CHIP等實(shí)驗(yàn)方法,研究GATA4調(diào)控miR-29a的分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.MTT、流式細(xì)胞分析及DAPI染色結(jié)果表明,miR-29a引起細(xì)胞增殖抑制、周期阻滯和誘導(dǎo)凋亡。2.Luciferase結(jié)果顯示,miR-29a能夠與預(yù)測(cè)的cyclin D2 3’-UTR區(qū)域發(fā)生特異性結(jié)合,從而降低熒光素酶活性。3.Western Blotting和QPCR進(jìn)一步證實(shí)了miR-29a可以在蛋白和m RNA水平下調(diào)cyclin D2的表達(dá),表明miR-29a通過(guò)轉(zhuǎn)錄后沉默機(jī)制抑制了cyclin D2的表達(dá),明確了cyclin D2確為miR-29a的靶基因。4.CHIP實(shí)驗(yàn)可知,GATA4招募PCG蛋白EZH2(PRC2),BMI1和RING1B(PRC1),H3K27me3富集于miR-29a的啟動(dòng)子區(qū)域,使其處于抑制狀態(tài)。5.CO-IP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步揭示GATA4與EZH2存在細(xì)胞內(nèi)相互作用,這些結(jié)果初步闡明GATA4抑制miR-29a轉(zhuǎn)錄活性的內(nèi)在分子機(jī)制。6.Western Blotting和QPCR證實(shí),GATA4能夠在m RNA水平抑制miR-29a,在蛋白和m RNA水平促進(jìn)cyclin D2的表達(dá)。7.C2C12分化過(guò)程中的CHIP實(shí)驗(yàn)可知,GATA4與PCG蛋白不結(jié)合到miR-29a的啟動(dòng)子區(qū)域。結(jié)論1.miR-29a通過(guò)下調(diào)其下游靶基因cyclin D2的表達(dá),抑制C2C12細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。2.在C2C12細(xì)胞中,GATA4通過(guò)招募Polycomb家族蛋白抑制miR-29a表達(dá),上調(diào)cyclin D2表達(dá),從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。3.在C2C12細(xì)胞分化過(guò)程中,GATA4與PCG蛋白不結(jié)合到miR-29a的啟動(dòng)子區(qū)域,對(duì)miR-29a表達(dá)的抑制作用消除,促進(jìn)分化。
【關(guān)鍵詞】：RMS GATA4 miR-29a cyclinD2 Polycomb
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R738.7
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-13
• 英文縮略詞13-14
• 1 引言14-17
• 2 實(shí)驗(yàn)材料17-21
• 2.1 質(zhì)粒、菌株與細(xì)胞系17
• 2.2 主要試劑17
• 2.3 主要溶液的配制17-21
• 3 實(shí)驗(yàn)方法21-36
• 3.1 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的建立21-22
• 3.1.1 C2C12細(xì)胞的培養(yǎng)21
• 3.1.2 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染21
• 3.1.3 G418篩選21-22
• 3.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建22-25
• 3.2.1 PCR擴(kuò)增目的片段22
• 3.2.2 PCR產(chǎn)物膠回收22-23
• 3.2.3 PCR產(chǎn)物及載體的雙酶切23
• 3.2.4 雙酶切產(chǎn)物膠回收23
• 3.2.5 目的基因與載體的連接23-24
• 3.2.6 制備感受態(tài)細(xì)胞24
• 3.2.7 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化24-25
• 3.2.8 挑單克隆25
• 3.2.9 小提質(zhì)粒及酶切鑒定25
• 3.2.10 重組質(zhì)粒的測(cè)序鑒定25
• 3.2.11 重組質(zhì)粒的大量提取25
• 3.3 熒光素酶活性測(cè)定Lμciferase25-26
• 3.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)26
• 3.5 流式細(xì)胞術(shù)（PI單染測(cè)細(xì)胞周期）26-27
• 3.6 DAPI染色27
• 3.7 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄27-30
• 3.7.1 細(xì)胞中總RNA的提取27-28
• 3.7.2 Oligo(d T)引物反轉(zhuǎn)錄28
• 3.7.3 莖環(huán)引物法反轉(zhuǎn)錄28-29
• 3.7.4 QPCR29-30
• 3.8 免疫共沉淀（CO-IP）與Western Blotting30-33
• 3.8.1 細(xì)胞核蛋白的提取30
• 3.8.2 Bradford法測(cè)定蛋白濃度30
• 3.8.3 免疫共沉淀（CO-IP）30-31
• 3.8.4 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)Western Blotting31-33
• 3.9 染色質(zhì)免疫共沉淀（CHIP）33-35
• 3.9.1 準(zhǔn)備CHIP樣品33-35
• 3.9.2 CHIP-QPCR35
• 3.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析35-36
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果36-50
• 4.1 miR-29a靶向cyclin D2調(diào)控細(xì)胞增殖、周期及凋亡36-43
• 4.1.1 miR-29a對(duì)細(xì)胞增殖的影響36-38
• 4.1.2 miR-29a對(duì)細(xì)胞周期的影響38-39
• 4.1.3 miR-29a對(duì)細(xì)胞核形態(tài)的影響39
• 4.1.4 利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-29a打靶的下游靶基因39-40
• 4.1.5 miR-29a與cyclin D23’-UTR結(jié)合40-41
• 4.1.6 miR-29a對(duì)cyclin D2蛋白及m RNA水平的影響41-43
• 4.2 GATA4招募PCG蛋白下調(diào)miR-29a表達(dá)，上調(diào)cyclin D2表達(dá)43-48
• 4.2.1 GATA4對(duì)miR-29a m RNA表達(dá)水平的影響43-44
• 4.2.2 GATA4與PCG蛋白在細(xì)胞內(nèi)相互作用44-45
• 4.2.3 GATA4將Polycomb家族蛋白招募到miR-29a的啟動(dòng)子區(qū)域45-47
• 4.2.4 GATA4對(duì)cyclin D2蛋白及m RNA表達(dá)水平的影響47-48
• 4.3 C2C12分化過(guò)程中，，GATA4與PCG蛋白不結(jié)合到miR-29a的啟動(dòng)子上48-50
• 5 討論50-54
• 6 結(jié)論54-55
• 7 參考文獻(xiàn)55-60
• 8 文獻(xiàn)綜述 miR-29 家族的角色：調(diào)節(jié)、功能及信號(hào)60-77
• 簡(jiǎn)介60-61
• 8.1 miR-29 及其調(diào)控61-62
• 8.2 miR-29 作為腫瘤抑制因子62-67
• 8.2.1 miR-29 的表觀遺傳調(diào)控作用62-64
• 8.2.2 miR-29 在細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和分化中的作用64-65
• 8.2.3 miR-29 在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲中的作用65-66
• 8.2.4 miR-29 和癌癥的化學(xué)敏感性66-67
• 8.3 miR-29 作為腫瘤促進(jìn)劑的功能67-68
• 8.4 miR-29 的靶基因68-69
• 8.5 miR-29 調(diào)控的信號(hào)通路69-70
• 8.6 結(jié)論和未來(lái)的發(fā)展方向70-71
• 參考文獻(xiàn)71-77
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷及在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文77-78
• 致謝78

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