本文關(guān)鍵詞：LncRNA在椎間盤(pán)退變過(guò)程中調(diào)控髓核細(xì)胞凋亡的功能及其機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：【目的】椎間盤(pán)的老化和退變是脊柱退變性疾病發(fā)生的前提條件和病理基礎(chǔ),理解椎間盤(pán)老化和退變的生物學(xué)機(jī)制,開(kāi)發(fā)有效的治療干預(yù)措施以應(yīng)對(duì)椎間盤(pán)退變帶來(lái)的健康問(wèn)題已經(jīng)成為當(dāng)前和未來(lái)全球性醫(yī)學(xué)難題之一。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析篩選髓核細(xì)胞凋亡調(diào)控相關(guān)的lncRNA,進(jìn)而探索lncRNA在椎間盤(pán)退變過(guò)程中髓核細(xì)胞凋亡調(diào)控的分子機(jī)制,從而為尋找椎間盤(pán)退變性疾病治療的新靶點(diǎn)提供科學(xué)指導(dǎo)�！痉椒ā�1、比較三種生物信息學(xué)分析軟件,應(yīng)用TargetScan軟件篩選可能通過(guò)miR-155參與髓核細(xì)胞凋亡調(diào)控的lncRNA。2、RT-PCR檢測(cè)髓核細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-155 mimics后lncRNA表達(dá)調(diào)控情況,通過(guò)lncRNA及mRNA芯片檢測(cè)評(píng)估髓核細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-155過(guò)表達(dá)慢病毒后lncRNA及mRNA表達(dá)譜變化,評(píng)估m(xù)iR-155作為基因治療靶點(diǎn)可能對(duì)髓核細(xì)胞功能產(chǎn)生的影響。3、流式細(xì)胞分析檢測(cè)過(guò)表達(dá)GAS5 lncRNA后髓核細(xì)胞的凋亡情況,Western Blot檢測(cè)線粒體通路上兩個(gè)關(guān)鍵凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和Bcl-2的表達(dá),驗(yàn)證GAS5 lncRNA對(duì)髓核細(xì)胞凋亡調(diào)控的影響,探索GAS lncRNA參與髓核細(xì)胞凋亡調(diào)控的可能機(jī)制。【結(jié)果】1、退變椎間盤(pán)髓核組織內(nèi)共有631個(gè)表達(dá)上調(diào)的lncRNA序列信息較為明確,其中有148個(gè)上調(diào)的lncRNA包含了178個(gè)hsa-miR-155-5p結(jié)合位點(diǎn)。符合Target Scan評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)的lncRNA有16個(gè),NR_002819含有6個(gè)hsa-miR-155-5p結(jié)合位點(diǎn),ENST00000511037、NR_027451包含了5個(gè)結(jié)合位點(diǎn),19個(gè)lncRNA包含了2個(gè)結(jié)合位點(diǎn),126個(gè)lncRNA包含了1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。2、GAS5 lncRNA包含了1個(gè)hsa-miR-155-5p結(jié)合位點(diǎn),外源性導(dǎo)入hsa-miR-155 mimics 72小時(shí)后,髓核細(xì)胞GAS5 lncRNA表達(dá)較陰性對(duì)照組明顯下降(P0.05)。lncRNA及mRNA表達(dá)譜芯片分析共發(fā)現(xiàn)721個(gè)差異表達(dá)lncRNA(Fc值≥2,P0.05),其中492個(gè)lncRNA表達(dá)上調(diào),229個(gè)lncRNA表達(dá)下調(diào)。芯片檢測(cè)的18個(gè)GAS5 lncRNA轉(zhuǎn)錄本均表達(dá)下調(diào),僅有GAS5-021表達(dá)具有顯著差異(Fc值≥1.5,P0.05)。Gene Ontology分析顯示,髓核細(xì)胞在miR-155過(guò)表達(dá)后基因表達(dá)發(fā)生了明顯的改變,主要集中在腫瘤、免疫性疾病、退變性疾病及心血管疾病等領(lǐng)域,其中以強(qiáng)直性脊柱炎及滑膜炎與椎間盤(pán)的關(guān)系最為密切。3、GAS5 lncRNA過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染96小時(shí)后,髓核細(xì)胞GAS5 lncRNA的表達(dá)水平提高(P0.05),凋亡蛋白酶Caspase-3表達(dá)上調(diào),凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào),髓核細(xì)胞的凋亡率較陰性對(duì)照組明顯升高(P0.05)。【結(jié)論】lncRNA在退變椎間盤(pán)髓核細(xì)胞凋亡調(diào)控中起到了重要作用,GAS5 lncRNA過(guò)表達(dá)使得髓核細(xì)胞內(nèi)線粒體凋亡通路上的兩個(gè)關(guān)鍵蛋白家族成員的表達(dá)均發(fā)生了變化,通過(guò)下調(diào)Bcl-2和上調(diào)Caspase-3的表達(dá),GAS5 lncRNA激活了髓核細(xì)胞內(nèi)的線粒體凋亡通路,進(jìn)而促進(jìn)髓核細(xì)胞的凋亡。GAS5 lncRNA在細(xì)胞內(nèi)監(jiān)管著線粒體凋亡途徑中促凋亡和抑凋亡分子之間的平衡,GAS5 lncRNA的表達(dá)狀態(tài)決定了細(xì)胞對(duì)凋亡刺激的敏感性。miR-155可能參與了GAS5 lncRNA的凋亡調(diào)控過(guò)程,兩者的相互調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。
【關(guān)鍵詞】：LncRNA 椎間盤(pán)退變 髓核細(xì)胞 細(xì)胞凋亡 線粒體凋亡通路 生物信息學(xué)分析
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R681.5
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-12
• 前言12-14
• 第一部分 TargetScan篩選退變椎間盤(pán)髓核細(xì)胞凋亡相關(guān)lncRNA的研究14-20
• 一、前言14-16
• 二、材料與方法16-17
• （一）獲取lncRNA序列信息16
• （二）miRNA研究情況及其序列信息16
• （三）TargetScan預(yù)測(cè)靶l(wèi)ncRNA16-17
• （四）篩選目標(biāo)lncRNA17
• 三、結(jié)果17-18
• 四、討論18-20
• 第二部分 hsa-miR-155 過(guò)表達(dá)髓核細(xì)胞lncRNA及mRNA表達(dá)譜芯片研究20-33
• 一、前言20-21
• 二、材料與方法21-26
• （一）椎間盤(pán)髓核細(xì)胞培養(yǎng)21
• （二）外源性hsa-miR-155 mimics及對(duì)照組雙鏈RNA合成21-22
• （三）髓核細(xì)胞轉(zhuǎn)染hsa-miR-155 mimics及對(duì)照組雙鏈RNA22
• （四）RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染hsa-miR-155 mimics后髓核細(xì)胞GAS5 lncRNA的表達(dá)22-24
• （五）hsa-miR-155 過(guò)表達(dá)慢病毒構(gòu)建24-25
• （六）hsa-miR-155 過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞25
• （七）hsa-miR-155 過(guò)表達(dá)后髓核細(xì)胞lncRNA及mRNA芯片檢測(cè)分析25-26
• 三、結(jié)果26-31
• （一）人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞生長(zhǎng)狀況26
• （二）hsa-miR-155 過(guò)表達(dá)后髓核細(xì)胞GAS5 lncRNA表達(dá)下降26-27
• （三）hsa-miR-155 過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染后髓核細(xì)胞生長(zhǎng)狀況27
• （四）樣品RNA芯片分析質(zhì)檢結(jié)果27-28
• （五）hsa-miR-155 過(guò)表達(dá)后髓核細(xì)胞lncRNA及mRNA芯片分析結(jié)果28-29
• （六）has-miR-155 過(guò)表達(dá)后髓核細(xì)胞GAS5 lncRNA各轉(zhuǎn)錄本檢測(cè)及表達(dá)29-31
• 四、討論31-33
• 第三部分 GAS5 lncRNA調(diào)控椎間盤(pán)髓核細(xì)胞凋亡的功能機(jī)制研究33-40
• 一、前言33
• 二、材料與方法33-36
• （一）GAS5 lncRNA過(guò)表達(dá)慢病毒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染33-34
• （二）GAS5 lncRNA過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞后RT-PCR檢測(cè)GAS5 lncRNA的表達(dá)34
• （三）蛋白質(zhì)抽提及western blot檢測(cè)34-35
• （四）流式細(xì)胞儀檢測(cè)髓核細(xì)胞凋亡率35-36
• 三、結(jié)果36-38
• （一）GAS5 lncRNA過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞后GAS5 lncRNA表達(dá)上調(diào)36
• （二）髓核細(xì)胞過(guò)表達(dá)GAS5 lncRNA后Caspase-3 及Bcl-2 蛋白表達(dá)變化36-37
• （三）髓核細(xì)胞過(guò)表達(dá)GAS5 lncRNA后細(xì)胞凋亡率增加37-38
• 四、討論38-40
• 全文總結(jié)40-41
• 綜述 GAS5 lncRNA在細(xì)胞生長(zhǎng)抑制及凋亡中的作用機(jī)制及其研究進(jìn)展41-49
• 參考文獻(xiàn)49-57
• 在讀期間發(fā)表論文和科研工作情況57-58
• 致謝58-59

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本文編號(hào)：420931