本文關鍵詞：LncRNA在椎間盤退變過程中調(diào)控髓核細胞凋亡的功能及其機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：【目的】椎間盤的老化和退變是脊柱退變性疾病發(fā)生的前提條件和病理基礎,理解椎間盤老化和退變的生物學機制,開發(fā)有效的治療干預措施以應對椎間盤退變帶來的健康問題已經(jīng)成為當前和未來全球性醫(yī)學難題之一。本研究通過生物信息學分析篩選髓核細胞凋亡調(diào)控相關的lncRNA,進而探索lncRNA在椎間盤退變過程中髓核細胞凋亡調(diào)控的分子機制,從而為尋找椎間盤退變性疾病治療的新靶點提供科學指導�！痉椒ā�1、比較三種生物信息學分析軟件,應用TargetScan軟件篩選可能通過miR-155參與髓核細胞凋亡調(diào)控的lncRNA。2、RT-PCR檢測髓核細胞轉(zhuǎn)染miR-155 mimics后lncRNA表達調(diào)控情況,通過lncRNA及mRNA芯片檢測評估髓核細胞轉(zhuǎn)染miR-155過表達慢病毒后lncRNA及mRNA表達譜變化,評估m(xù)iR-155作為基因治療靶點可能對髓核細胞功能產(chǎn)生的影響。3、流式細胞分析檢測過表達GAS5 lncRNA后髓核細胞的凋亡情況,Western Blot檢測線粒體通路上兩個關鍵凋亡相關蛋白Caspase-3和Bcl-2的表達,驗證GAS5 lncRNA對髓核細胞凋亡調(diào)控的影響,探索GAS lncRNA參與髓核細胞凋亡調(diào)控的可能機制�！窘Y(jié)果】1、退變椎間盤髓核組織內(nèi)共有631個表達上調(diào)的lncRNA序列信息較為明確,其中有148個上調(diào)的lncRNA包含了178個hsa-miR-155-5p結(jié)合位點。符合Target Scan評分標準的lncRNA有16個,NR_002819含有6個hsa-miR-155-5p結(jié)合位點,ENST00000511037、NR_027451包含了5個結(jié)合位點,19個lncRNA包含了2個結(jié)合位點,126個lncRNA包含了1個結(jié)合位點。2、GAS5 lncRNA包含了1個hsa-miR-155-5p結(jié)合位點,外源性導入hsa-miR-155 mimics 72小時后,髓核細胞GAS5 lncRNA表達較陰性對照組明顯下降(P0.05)。lncRNA及mRNA表達譜芯片分析共發(fā)現(xiàn)721個差異表達lncRNA(Fc值≥2,P0.05),其中492個lncRNA表達上調(diào),229個lncRNA表達下調(diào)。芯片檢測的18個GAS5 lncRNA轉(zhuǎn)錄本均表達下調(diào),僅有GAS5-021表達具有顯著差異(Fc值≥1.5,P0.05)。Gene Ontology分析顯示,髓核細胞在miR-155過表達后基因表達發(fā)生了明顯的改變,主要集中在腫瘤、免疫性疾病、退變性疾病及心血管疾病等領域,其中以強直性脊柱炎及滑膜炎與椎間盤的關系最為密切。3、GAS5 lncRNA過表達慢病毒轉(zhuǎn)染96小時后,髓核細胞GAS5 lncRNA的表達水平提高(P0.05),凋亡蛋白酶Caspase-3表達上調(diào),凋亡抑制蛋白Bcl-2表達下調(diào),髓核細胞的凋亡率較陰性對照組明顯升高(P0.05)�！窘Y(jié)論】lncRNA在退變椎間盤髓核細胞凋亡調(diào)控中起到了重要作用,GAS5 lncRNA過表達使得髓核細胞內(nèi)線粒體凋亡通路上的兩個關鍵蛋白家族成員的表達均發(fā)生了變化,通過下調(diào)Bcl-2和上調(diào)Caspase-3的表達,GAS5 lncRNA激活了髓核細胞內(nèi)的線粒體凋亡通路,進而促進髓核細胞的凋亡。GAS5 lncRNA在細胞內(nèi)監(jiān)管著線粒體凋亡途徑中促凋亡和抑凋亡分子之間的平衡,GAS5 lncRNA的表達狀態(tài)決定了細胞對凋亡刺激的敏感性。miR-155可能參與了GAS5 lncRNA的凋亡調(diào)控過程,兩者的相互調(diào)控機制有待進一步的研究。
【關鍵詞】：LncRNA 椎間盤退變 髓核細胞 細胞凋亡 線粒體凋亡通路 生物信息學分析
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R681.5
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-12
• 前言12-14
• 第一部分 TargetScan篩選退變椎間盤髓核細胞凋亡相關lncRNA的研究14-20
• 一、前言14-16
• 二、材料與方法16-17
• （一）獲取lncRNA序列信息16
• （二）miRNA研究情況及其序列信息16
• （三）TargetScan預測靶l(wèi)ncRNA16-17
• （四）篩選目標lncRNA17
• 三、結(jié)果17-18
• 四、討論18-20
• 第二部分 hsa-miR-155 過表達髓核細胞lncRNA及mRNA表達譜芯片研究20-33
• 一、前言20-21
• 二、材料與方法21-26
• （一）椎間盤髓核細胞培養(yǎng)21
• （二）外源性hsa-miR-155 mimics及對照組雙鏈RNA合成21-22
• （三）髓核細胞轉(zhuǎn)染hsa-miR-155 mimics及對照組雙鏈RNA22
• （四）RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染hsa-miR-155 mimics后髓核細胞GAS5 lncRNA的表達22-24
• （五）hsa-miR-155 過表達慢病毒構(gòu)建24-25
• （六）hsa-miR-155 過表達慢病毒轉(zhuǎn)染髓核細胞25
• （七）hsa-miR-155 過表達后髓核細胞lncRNA及mRNA芯片檢測分析25-26
• 三、結(jié)果26-31
• （一）人椎間盤髓核細胞生長狀況26
• （二）hsa-miR-155 過表達后髓核細胞GAS5 lncRNA表達下降26-27
• （三）hsa-miR-155 過表達慢病毒轉(zhuǎn)染后髓核細胞生長狀況27
• （四）樣品RNA芯片分析質(zhì)檢結(jié)果27-28
• （五）hsa-miR-155 過表達后髓核細胞lncRNA及mRNA芯片分析結(jié)果28-29
• （六）has-miR-155 過表達后髓核細胞GAS5 lncRNA各轉(zhuǎn)錄本檢測及表達29-31
• 四、討論31-33
• 第三部分 GAS5 lncRNA調(diào)控椎間盤髓核細胞凋亡的功能機制研究33-40
• 一、前言33
• 二、材料與方法33-36
• （一）GAS5 lncRNA過表達慢病毒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染33-34
• （二）GAS5 lncRNA過表達慢病毒轉(zhuǎn)染髓核細胞后RT-PCR檢測GAS5 lncRNA的表達34
• （三）蛋白質(zhì)抽提及western blot檢測34-35
• （四）流式細胞儀檢測髓核細胞凋亡率35-36
• 三、結(jié)果36-38
• （一）GAS5 lncRNA過表達慢病毒轉(zhuǎn)染髓核細胞后GAS5 lncRNA表達上調(diào)36
• （二）髓核細胞過表達GAS5 lncRNA后Caspase-3 及Bcl-2 蛋白表達變化36-37
• （三）髓核細胞過表達GAS5 lncRNA后細胞凋亡率增加37-38
• 四、討論38-40
• 全文總結(jié)40-41
• 綜述 GAS5 lncRNA在細胞生長抑制及凋亡中的作用機制及其研究進展41-49
• 參考文獻49-57
• 在讀期間發(fā)表論文和科研工作情況57-58
• 致謝58-59

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