發(fā)布時間：2017-05-18 16:08

  本文關鍵詞：腎上腺素能受體活化促肝臟生物支架再細胞化的作用及其機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：一、背景肝臟疾病遷延至終末期普遍會導致肝功能衰竭。肝移植是目前國際公認的治療肝功能衰竭最有效的方法。但供體肝臟數(shù)量不足成為限制肝移植發(fā)展最大的問題。全器官灌注法制備的肝臟生物支架以及再細胞化肝臟具有特殊的生物學優(yōu)勢,有望將來替代終末期衰竭的肝臟,解決供體肝臟不足的問題。但目前再細胞化肝臟與正常肝臟相比仍有較大差距,再細胞化肝臟多途徑模擬正常肝臟的培養(yǎng)微環(huán)境是目前研究的熱點。交感神經(jīng)是肝臟重要的組成部分并調節(jié)肝臟各項生理、病理的過程,特別是在肝臟的修復與再生中發(fā)揮了重要的作用。本課題組前期的研究已證實阻斷交感神經(jīng)可降低肝臟再生的速率。然而,交感神經(jīng)遞質是否對肝臟生物支架再細胞化具有調節(jié)作用,還未見文獻報道。二、目的明確不同腎上腺素能受體激動劑對肝臟生物支架內細胞增殖的作用,以及對再細胞化肝臟的影響,探討腎上腺素能受體亞型活化后發(fā)揮相應作用的相關分子機制,為完善再細胞化肝臟的制備與培養(yǎng)提供新的科學依據(jù)。三、方法1.使用全器官灌注法制備C57小鼠肝臟生物支架,行蘇木精伊紅染色和Massion染色,檢測肝臟生物支架內DNA殘留量,明確肝臟生物支架制備的效果;多步灌注法制備再細胞化肝臟,行免疫熒光化學檢驗,明確再細胞化肝臟內細胞生長情況。2.使用RT-PCR和免疫熒光化學的方法檢測種子細胞(L02細胞)腎上腺素能受體及亞型AR-α1A、AR-α1B、AR-α1D、AR-α2A、AR-α2B、AR-α2C、AR-β1、AR-β2、AR-β3的表達情況。3.使用Cell Titer-Blue的檢測方法檢測瓶皿培養(yǎng)下不同交感神經(jīng)遞質及腎上腺素能受體激動劑對L02細胞增殖的作用;使用Click-iT Plus Edu的檢測方法檢測肝臟生物支架內腎上腺素能受體活化對L02細胞增殖、粘附的作用,鑒定其再細胞化的效果。4.使用elisa的方法檢測腎上腺素能受體活化對再細胞化肝臟內白蛋白分泌和尿素合成水平的影響,明確其對再細胞化肝臟功能的促進作用。5.使用rt-pcr的方法檢測tnf-α、il-6、icam-1、ngf和tgf-β細胞因子的表達,使用westernblot的方法檢測smad3、stat3、p38、jnk-1和akt-1關鍵信號蛋白的表達,闡明腎上腺素能受體亞型活化促進再細胞化肝臟內細胞增殖的分子機制。四、結果1.全器官灌注法成功制備肝臟生物支架。體視顯微鏡下可清晰觀察到肝小葉內的微脈管系統(tǒng),肝臟生物支架(114.027±5.526ng/mg)和正常肝臟(9450.087±234.387ng/mg)dna含量之間具有顯著性差異,he染色觀察到肝臟生物支架內基本看不到藍染的細胞核,并且保留了基本的生物骨架結構,massion染色觀察到肝臟生物支架內含有大量纖維蛋白和彈性蛋白成分。成功運用全器官灌注法制備再細胞化肝臟。he染色觀察到細胞穩(wěn)定附著于支架內,massion染色觀察到再細胞化肝臟內有大量正常細胞和細胞外基質成分。激光共聚焦顯微鏡觀察到細胞數(shù)量隨培養(yǎng)時間而增長。2.l02細胞膜表面表達多種腎上腺素能受體及其亞型。rt-pcr檢測發(fā)現(xiàn)ar-α1d和ar-β2受體亞型表達相對較高,而ar-α1a和ar-α2b幾乎不表達,其余的受體亞型均有一定程度的表達。細胞免疫熒光化學染色觀察到ar-β2受體亞型的表達量相對較高。3.ar-β2受體亞型活化后可以促進瓶皿培養(yǎng)以及肝臟生物支架內的l02細胞增殖,并促進再細胞化肝臟白蛋白分泌和尿素合成。4.在ar-β2受體亞型活化調節(jié)再細胞化肝臟的過程中,通過rt-pcr篩選多種信號分子發(fā)現(xiàn)il-6表達升高并具有顯著性差異,而tnf-α、icam-1、ngf、tgf-β表達沒有變化。5.在ar-β2受體亞型活化調節(jié)再細胞化肝臟的過程中,通過westernblot檢驗了多個關鍵信號蛋白,發(fā)現(xiàn)stat3蛋白及磷酸化stat3蛋白的表達顯著增強,而smad3、p38、jnk-1和akt-1蛋白的表達沒有顯著變化。表明il-6/stat3信號通路的激活對β2受體活化后肝臟生物支架內l02細胞增殖具有關鍵作用,進而提升再細胞化肝臟白蛋白分泌和尿素合成。五、結論本研究證實了交感神經(jīng)遞質可以顯著促進肝臟生物支架再細胞化,其機制是通過AR-β2受體亞型活化調節(jié)IL-6/Stat3信號通路促進肝臟生物支架內肝細胞的增殖。
【關鍵詞】：肝臟生物支架 再細胞化肝臟 腎上腺素能受體 組織工程
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R657.3;R318.08
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 英文摘要6-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 前言12-14
• 第二章 肝臟生物支架和再細胞化肝臟的制備14-26
• 2.1 材料和方法14-20
• 2.2 結果20-24
• 2.3 討論24-26
• 第三章 不同交感神經(jīng)遞質對肝臟生物支架內肝細胞增殖的作用26-45
• 3.1 材料和方法26-33
• 3.2 結果33-43
• 3.3 討論43-45
• 第四章 腎上腺素能受體活化介導IL-6/Stat3信號通路促肝細胞增殖45-54
• 4.1 材料和方法45-50
• 4.2 結果50-53
• 4.3 討論53-54
• 全文總結54-55
• 參考文獻55-60
• 文獻綜述 肝臟生物支架內干細胞參與肝再生的研究與臨床應用60-71
• 參考文獻66-71
• 攻讀學位期間的研究成果71-72
• 致謝72

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  本文關鍵詞：腎上腺素能受體活化促肝臟生物支架再細胞化的作用及其機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：376484