本文關(guān)鍵詞：腎上腺素能受體活化促肝臟生物支架再細(xì)胞化的作用及其機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：一、背景肝臟疾病遷延至終末期普遍會導(dǎo)致肝功能衰竭。肝移植是目前國際公認(rèn)的治療肝功能衰竭最有效的方法。但供體肝臟數(shù)量不足成為限制肝移植發(fā)展最大的問題。全器官灌注法制備的肝臟生物支架以及再細(xì)胞化肝臟具有特殊的生物學(xué)優(yōu)勢,有望將來替代終末期衰竭的肝臟,解決供體肝臟不足的問題。但目前再細(xì)胞化肝臟與正常肝臟相比仍有較大差距,再細(xì)胞化肝臟多途徑模擬正常肝臟的培養(yǎng)微環(huán)境是目前研究的熱點。交感神經(jīng)是肝臟重要的組成部分并調(diào)節(jié)肝臟各項生理、病理的過程,特別是在肝臟的修復(fù)與再生中發(fā)揮了重要的作用。本課題組前期的研究已證實阻斷交感神經(jīng)可降低肝臟再生的速率。然而,交感神經(jīng)遞質(zhì)是否對肝臟生物支架再細(xì)胞化具有調(diào)節(jié)作用,還未見文獻(xiàn)報道。二、目的明確不同腎上腺素能受體激動劑對肝臟生物支架內(nèi)細(xì)胞增殖的作用,以及對再細(xì)胞化肝臟的影響,探討腎上腺素能受體亞型活化后發(fā)揮相應(yīng)作用的相關(guān)分子機制,為完善再細(xì)胞化肝臟的制備與培養(yǎng)提供新的科學(xué)依據(jù)。三、方法1.使用全器官灌注法制備C57小鼠肝臟生物支架,行蘇木精伊紅染色和Massion染色,檢測肝臟生物支架內(nèi)DNA殘留量,明確肝臟生物支架制備的效果;多步灌注法制備再細(xì)胞化肝臟,行免疫熒光化學(xué)檢驗,明確再細(xì)胞化肝臟內(nèi)細(xì)胞生長情況。2.使用RT-PCR和免疫熒光化學(xué)的方法檢測種子細(xì)胞(L02細(xì)胞)腎上腺素能受體及亞型AR-α1A、AR-α1B、AR-α1D、AR-α2A、AR-α2B、AR-α2C、AR-β1、AR-β2、AR-β3的表達(dá)情況。3.使用Cell Titer-Blue的檢測方法檢測瓶皿培養(yǎng)下不同交感神經(jīng)遞質(zhì)及腎上腺素能受體激動劑對L02細(xì)胞增殖的作用;使用Click-iT Plus Edu的檢測方法檢測肝臟生物支架內(nèi)腎上腺素能受體活化對L02細(xì)胞增殖、粘附的作用,鑒定其再細(xì)胞化的效果。4.使用elisa的方法檢測腎上腺素能受體活化對再細(xì)胞化肝臟內(nèi)白蛋白分泌和尿素合成水平的影響,明確其對再細(xì)胞化肝臟功能的促進作用。5.使用rt-pcr的方法檢測tnf-α、il-6、icam-1、ngf和tgf-β細(xì)胞因子的表達(dá),使用westernblot的方法檢測smad3、stat3、p38、jnk-1和akt-1關(guān)鍵信號蛋白的表達(dá),闡明腎上腺素能受體亞型活化促進再細(xì)胞化肝臟內(nèi)細(xì)胞增殖的分子機制。四、結(jié)果1.全器官灌注法成功制備肝臟生物支架。體視顯微鏡下可清晰觀察到肝小葉內(nèi)的微脈管系統(tǒng),肝臟生物支架(114.027±5.526ng/mg)和正常肝臟(9450.087±234.387ng/mg)dna含量之間具有顯著性差異,he染色觀察到肝臟生物支架內(nèi)基本看不到藍(lán)染的細(xì)胞核,并且保留了基本的生物骨架結(jié)構(gòu),massion染色觀察到肝臟生物支架內(nèi)含有大量纖維蛋白和彈性蛋白成分。成功運用全器官灌注法制備再細(xì)胞化肝臟。he染色觀察到細(xì)胞穩(wěn)定附著于支架內(nèi),massion染色觀察到再細(xì)胞化肝臟內(nèi)有大量正常細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)成分。激光共聚焦顯微鏡觀察到細(xì)胞數(shù)量隨培養(yǎng)時間而增長。2.l02細(xì)胞膜表面表達(dá)多種腎上腺素能受體及其亞型。rt-pcr檢測發(fā)現(xiàn)ar-α1d和ar-β2受體亞型表達(dá)相對較高,而ar-α1a和ar-α2b幾乎不表達(dá),其余的受體亞型均有一定程度的表達(dá)。細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色觀察到ar-β2受體亞型的表達(dá)量相對較高。3.ar-β2受體亞型活化后可以促進瓶皿培養(yǎng)以及肝臟生物支架內(nèi)的l02細(xì)胞增殖,并促進再細(xì)胞化肝臟白蛋白分泌和尿素合成。4.在ar-β2受體亞型活化調(diào)節(jié)再細(xì)胞化肝臟的過程中,通過rt-pcr篩選多種信號分子發(fā)現(xiàn)il-6表達(dá)升高并具有顯著性差異,而tnf-α、icam-1、ngf、tgf-β表達(dá)沒有變化。5.在ar-β2受體亞型活化調(diào)節(jié)再細(xì)胞化肝臟的過程中,通過westernblot檢驗了多個關(guān)鍵信號蛋白,發(fā)現(xiàn)stat3蛋白及磷酸化stat3蛋白的表達(dá)顯著增強,而smad3、p38、jnk-1和akt-1蛋白的表達(dá)沒有顯著變化。表明il-6/stat3信號通路的激活對β2受體活化后肝臟生物支架內(nèi)l02細(xì)胞增殖具有關(guān)鍵作用,進而提升再細(xì)胞化肝臟白蛋白分泌和尿素合成。五、結(jié)論本研究證實了交感神經(jīng)遞質(zhì)可以顯著促進肝臟生物支架再細(xì)胞化,其機制是通過AR-β2受體亞型活化調(diào)節(jié)IL-6/Stat3信號通路促進肝臟生物支架內(nèi)肝細(xì)胞的增殖。
【關(guān)鍵詞】：肝臟生物支架 再細(xì)胞化肝臟 腎上腺素能受體 組織工程
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R657.3;R318.08
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 英文摘要6-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 前言12-14
• 第二章 肝臟生物支架和再細(xì)胞化肝臟的制備14-26
• 2.1 材料和方法14-20
• 2.2 結(jié)果20-24
• 2.3 討論24-26
• 第三章 不同交感神經(jīng)遞質(zhì)對肝臟生物支架內(nèi)肝細(xì)胞增殖的作用26-45
• 3.1 材料和方法26-33
• 3.2 結(jié)果33-43
• 3.3 討論43-45
• 第四章 腎上腺素能受體活化介導(dǎo)IL-6/Stat3信號通路促肝細(xì)胞增殖45-54
• 4.1 材料和方法45-50
• 4.2 結(jié)果50-53
• 4.3 討論53-54
• 全文總結(jié)54-55
• 參考文獻(xiàn)55-60
• 文獻(xiàn)綜述 肝臟生物支架內(nèi)干細(xì)胞參與肝再生的研究與臨床應(yīng)用60-71
• 參考文獻(xiàn)66-71
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果71-72
• 致謝72

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