本文關(guān)鍵詞：人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)外對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞表型及IL-10表達(dá)的影響研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:探討人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(human amniotic mesenchymal stem cells,h AMSCs)在體內(nèi)外對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞表型及IL-10表達(dá)的影響,求證h AMSC是否具有調(diào)控小鼠巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及促進(jìn)IL-10表達(dá)的作用,以完善h AMSC促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機(jī)制研究,為進(jìn)一步轉(zhuǎn)化到臨床提供基礎(chǔ)研究資料。方法:1、采用胰酶-膠原酶二步消化法分離h AMSCs,差速貼壁,DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)、純化,傳代至P4代,MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活的OD值,繪制培養(yǎng)1-7天生長(zhǎng)曲線(xiàn),采用流式細(xì)胞儀鑒定并成脂及成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)h AMSCs。2、腹腔灌洗法提取10只C57BL/6野生小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個(gè)/m L,每孔1m L接種于6孔培養(yǎng)板,去除未貼壁細(xì)胞后使用含INF-γ(M1型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)劑)的DMEM培養(yǎng)基2m L培養(yǎng),細(xì)胞吞噬試驗(yàn)鑒定。3、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)5天后移除6孔板內(nèi)含INF-γ的DMEM培養(yǎng)基,設(shè)立h AMSCs共培養(yǎng)組及單獨(dú)培養(yǎng)組,每組3孔,h AMSCs共培養(yǎng)組每孔加入1×104個(gè)P4代h AMSCs(h AMSCs巨噬細(xì)胞比為1:10)后予DMEM培養(yǎng)基2m L培養(yǎng),單獨(dú)培養(yǎng)組予DMEM培養(yǎng)基2m L培養(yǎng)。ELISA法于共培養(yǎng)后1天、7天檢測(cè)各組上清液中IL-12(M1型巨噬細(xì)胞型分泌)、Arg-I(M2型巨噬細(xì)胞型分泌)及IL-10含量。4、取56只雄性健康C57BL/6野生小鼠建立背部全層皮膚缺損模型,剔除小鼠背部毛發(fā),在脊柱兩側(cè)分別設(shè)計(jì)并切除10mm×10mm大小正方形全層皮膚。設(shè)立h AMSCs移植組及對(duì)照組,每組28只,h AMSCs移植組小鼠于每個(gè)背部創(chuàng)面周?chē)帱c(diǎn)皮下注射以DMEM培養(yǎng)基配制濃度為1×106個(gè)/100μL的P4代h AMSCs細(xì)胞懸液100μL,對(duì)照組小鼠于每個(gè)背部創(chuàng)面注射100μL DMEM培養(yǎng)基。5、取2只雄性健康C57BL/6野生小鼠建立背部全層皮膚缺損模型,創(chuàng)面周?chē)帱c(diǎn)注射100μL細(xì)胞密度為1×106個(gè)/100μL CM-Dil標(biāo)記的h AMSCs細(xì)胞懸液,14天后切取創(chuàng)面組織,熒光顯微鏡下對(duì)移植h AMSCs進(jìn)行示蹤。6、小鼠背部皮膚缺損模型建立后1天、3天、7天、14天觀察各組小鼠創(chuàng)面愈合情況,測(cè)量創(chuàng)面面積,計(jì)算每組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)愈合率。并于以上各時(shí)間點(diǎn)擴(kuò)大切取創(chuàng)面組織,組織石蠟切片HE染色觀察炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)情況;冰凍切片免疫熒光雙染色分別觀察組織中CD68與i NOS雙陽(yáng)性(M1型巨噬細(xì)胞)、CD68與Arg-I雙陽(yáng)性(M2型巨噬細(xì)胞)表達(dá)情況;q PCR檢測(cè)創(chuàng)面組織抗炎因子IL-10基因的表達(dá)情況。結(jié)果:1、采用胰酶-膠原酶二步消化法可獲得大量穩(wěn)定增殖的h AMSCs。h AMSCs原代接種48h可見(jiàn)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),P4代h AMSCs細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)呈“S”形,3-5天呈指數(shù)生長(zhǎng)期,然后進(jìn)入平臺(tái)期,細(xì)胞停止增殖。流式細(xì)胞鑒定:細(xì)胞表面CD73(98.1%)、CD90(96.7%)、CD105(95.1%)呈陽(yáng)性,CD45、CD34、CD11b、CD19、HLA-DR陰性(0.5%)。細(xì)胞成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)21天后行油紅O染色可見(jiàn)紅色脂滴,成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21天后行茜素紅染色可見(jiàn)紅色鈣化結(jié)節(jié)。2、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞呈圓形或橢圓形、梭形、不規(guī)則形,細(xì)胞表面伸出許多刺毛狀小突起,并對(duì)墨汁顆粒具有吞噬作用,吞噬百分率為85%。3、ELISA法檢測(cè)h AMSCs共培養(yǎng)組1天、7天上清液IL-12濃度分別為43.36±1.93ng/L、22.22±1.47ng/L,Arg-I濃度分別為5.48±1.38 U/L、12.52±0.46 U/L,IL-10濃度分別為65.35±5.99 ng/L、220.69±7.11ng/L;單獨(dú)培養(yǎng)組1天、7天上清液IL-12濃度分別為42.74±2.42ng/L、33.08±1.10ng/L,Arg-I濃度分別為5.13±0.48 U/L、6.07±0.13U/L;IL-10濃度分別為62.48±2.17 ng/L、75.54±7.50 ng/L�？梢�(jiàn)第7天h AMSCs共培養(yǎng)組上清液IL-12濃度較巨噬細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組低,而上清液中Arg-I、IL-10含量較巨噬細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組高(P0.05)。4、h AMSCs移植組1天、3天、7天、14天創(chuàng)面愈合率分別為(1.23±0.39)%、(33.93±2.71)%、(75.17±3.69)%、(98.14±1.66)%;對(duì)照組1天、3天、7天、14天創(chuàng)面愈合率分別為(1.11±0.11)%、(27.29±3.41)%、(62.37±5.24)%(95.46±2.56)%。可見(jiàn)h AMSCs移植組創(chuàng)面3天、7天、14天創(chuàng)面愈合率優(yōu)于對(duì)照組(P0.05)。5、h AMSCs移植后14天所取組織冰凍切片于熒光顯微鏡觀察可見(jiàn)h AMSCs移植組中存在散在熒光分布,提示局部移植的h AMSCs在建模14天后依舊存活。6、HE染色觀察可見(jiàn)h AMSCs移植組創(chuàng)面3天、7天炎性細(xì)胞浸潤(rùn)相對(duì)模型對(duì)照組少。7、免疫熒光染色結(jié)果顯示h AMSCs移植組1天、3天、7天、14天的CD68與i NOS雙陽(yáng)性細(xì)胞百分比分別是(36.84±5.52)%、(32.73±3.56)%、(18.17±1.33)%、(5.41±2.19)%,CD68與Arg-I雙陽(yáng)性細(xì)胞百分比分別是(2.08±1.04)%、(30.18±4.13)%、(38.74±3.71)%、(21.01±1.75)%;模型對(duì)照組1天、3天、7天、14天的CD68與i NOS雙陽(yáng)性細(xì)胞百分比分別是(37.29±6.78)%、(43.97±2.98)%、(23.31±2.51)%、(6.51±1.28)%,CD68與Arg-I雙陽(yáng)性細(xì)胞百分比分別是(1.59±1.54)%、(23.58±1.66)%、(31.06±2.61)%、(18.71±1.58)%�？梢�(jiàn)h AMSCs移植組M1型巨噬細(xì)胞陽(yáng)性率在3天、7天低于模型對(duì)照組,M2型巨噬細(xì)胞陽(yáng)性率在3天、7天高于模型對(duì)照組(P0.05)。8、q PCR檢查結(jié)果顯示小鼠背部皮膚全層缺損模型建立后h AMSCs移植組1天、3天、7天、14天創(chuàng)面組織IL-10基因相對(duì)GAPDH基因表達(dá)量分別為0.0152±0.0025、0.2827±0.0133、0.0535±0.0054、0.0209±0.0055;模型對(duì)照組1天、3天、7天、14天創(chuàng)面組織IL-10基因相對(duì)GAPDH基因表達(dá)量分別為0.0127±0.0021、0.1208±0.0043、0.0326±0.0046、0.0148±0.0021�？梢�(jiàn)對(duì)照組及模型組相比3天、7天h AMSCs移植組創(chuàng)面組織IL-10的基因表達(dá)高于模型對(duì)照組(P0.05)。結(jié)論:1、h AMSCs具有促進(jìn)小鼠M1型巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化的作用;2、h AMSCs具有促進(jìn)小鼠皮膚創(chuàng)面愈合的生物學(xué)效應(yīng),其可能部分與h AMSCs促進(jìn)創(chuàng)M1型巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化,上調(diào)創(chuàng)面局部IL-10的表達(dá),抑制創(chuàng)面炎癥反應(yīng)有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞 巨噬細(xì)胞 IL-10 創(chuàng)面愈合
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R641
【目錄】：

• 中英縮略詞對(duì)照表4-5
• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 前言12-13
• 實(shí)驗(yàn)材料13-15
• 實(shí)驗(yàn)方法15-22
• 結(jié)果22-37
• 討論37-39
• 結(jié)論39-40
• 參考文獻(xiàn)40-42
• 綜述42-50
• 參考文獻(xiàn)47-50
• 致謝50-51
• 作者簡(jiǎn)介51

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  本文關(guān)鍵詞：人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)外對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞表型及IL-10表達(dá)的影響研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：372415