發(fā)布時間：2017-05-12 15:20

  本文關(guān)鍵詞：外周血間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)巨噬細胞極化與重編程的體外研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:觀察外周血來源的間充質(zhì)干細胞(Peripheral Blood-Derived Mesenchymal Stem Cells,PB-MSCs)對巨噬細胞免疫修飾作用的影響并初步探索其分子調(diào)節(jié)機制。方法:1、大鼠PB-MSCs及骨髓來源的間充質(zhì)干細胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cells,BM-MSC)的分離培養(yǎng)與鑒定:SPF級SD大鼠10只(150-250 g),腹腔注射100μg·kg-1·d 1粒細胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF),連續(xù)給藥5 d,于最后一次注射后,立即腹腔注射5 mg·kg 1AMD3100,1 h之后分別采集骨髓和外周血,密度梯度離心法收集骨髓單個核細胞(BM-MNCs)和外周血單個核細胞(PB-MNCs),其中PB-MNCs以5×106個/ml細胞密度接種于含15%FBS的MSCs適應(yīng)性培養(yǎng)基(ACM)/HG-DMEM(V ACM:V HG-DMEM=1:1)中,BM-MNCs以5×106個/ml細胞密度接種于15%FBS的HG-DMEM中,經(jīng)傳代培養(yǎng)純化BM-MSCs和PB-MSCs。取第三代BM-MSCs和PB-MSCs,采用流式細胞術(shù)檢測兩種細胞的CD34、CD45、CD90、CD44、CD29、G-CSFR表型特征,之后,再分別行成脂、成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng),油紅O、茜素紅染色進行鑒定;熒光定量PCR(Q-PCR)分別檢測兩種細胞的成骨分化相關(guān)基因Runx2、SOX2、BSP和成脂分化有關(guān)基因Wnt 5b、PPARγ的m RNA表達情況,并對巨噬細胞IL-6、IL-1β、IFNγ、IL-10、TGF-β炎癥因子m RNA表達進行檢測;Western blot檢測兩種細胞炎癥調(diào)節(jié)相關(guān)核轉(zhuǎn)錄因子Twist1的表達。2、大鼠M0型巨噬細胞的分離、培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化為M1和M2型巨噬細胞:用含20%L929細胞條件培養(yǎng)基、10%FBS的RIPM-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠骨髓細胞(1×105個/ml密度接種),6天后得到純化的M0型巨噬細胞,分別采用LPS或IL-4聯(lián)合IL-10誘導(dǎo)24 h,得到M1和M2型巨噬細胞。3、PB-MSCs對M0型巨噬細胞誘導(dǎo)極化能力研究:采用PB-MSCs與M0型巨噬細胞間接共培養(yǎng)實驗進行分析,實驗分組包括:對照組(M0)、LPS誘導(dǎo)組(M1)、IL-4+IL-10誘導(dǎo)組(M2)、PB-MSCs與M0巨噬細胞共培養(yǎng)組(M P-T)、BM-MSCs與M0巨噬細胞共培養(yǎng)組(M B-T),其中PB-MSCs或BM-MSCs(1×105個)接種于Transwell小室中并與M0型巨噬細胞(1×105個)進行共培養(yǎng)3天,Q-PCR檢測巨噬細胞IL-6、IL-10、IL-1β、CCL22、TGF-β等基因m RNA表達特點,流式細胞術(shù)分析巨噬細胞CD206、CD68、CD11b、i NOS、Arginase 1、TNFα的表型特征。4、PB-MSCs對M1型巨噬細胞重編程能力研究:實驗分為采用PB-MSCs和BM-MSCs與M1型巨噬細胞直接共培養(yǎng)(分別為M P-C和M B-C兩個組),PB-MSCs或BM-MSCs(1×105個)直接接種于已貼壁的M1型巨噬細胞(1×105個)中進行共培養(yǎng),3天后使用流式細胞術(shù)分析CD11b陽性巨噬細胞CD206、i NOS、Arginase 1、TNFα的表達情況,二氫乙啶(DHE)染色分析活性氧簇(ROS)的表達。結(jié)果:1、分離培養(yǎng)的大鼠PB-MSC與BM-MSCs形態(tài)成纖維樣細胞樣,均不同程度表達CD90、CD44、CD29、G-CSFR,不表達CD34、CD45;成脂定向誘導(dǎo)后,油紅O染色可見脂滴形成,成骨定向誘導(dǎo)后,茜素S染色可見磷酸鹽結(jié)晶,但在相同的誘導(dǎo)天數(shù)時PB-MSCs較BM-MSCs形成的脂滴更大且較多,而磷酸鹽結(jié)晶卻少于BM-MSCs。2、Q-PCR檢測發(fā)現(xiàn),與BM-MSCs相比,PB-MSCs的Runx2、SOX2、BSP等成骨相關(guān)基因表達較低,而成脂相關(guān)基因Wnt 5b、PPARγ表達較高。3、Q-PCR進一步分析發(fā)現(xiàn),PB-MSC與BM-MSCs相比,IL-6、IL-1β、IFNγ、TGF-β表達較低,而IL-10表達較高,而Western blot顯示PB-MSCs的twist1蛋白表達水平低于BM-MSCs。4、在Transwell間接共培養(yǎng)體系下,PB-MSCs和BM-MSCs均可誘導(dǎo)M0型巨噬細胞向M2型極化,表現(xiàn)為CD206、CD68、CD11b、Arg-1、IL-10表達上調(diào),而i NOS、TNFα、IL-6、IL-1β、CCL22表達下調(diào)。間接共培養(yǎng)后的巨噬細胞M P-T較M B-T相比CD206、CD68、CD11b、Arg-1、IL-10、CCL22表達較高,而i NOS、TNFα、IL-6、IL-1β表達較低。5、在直接共培養(yǎng)體系中,PB-MSCs和BM-MSCs均可使M1巨噬細胞向M2型轉(zhuǎn)變,表現(xiàn)為代表M2型巨噬細胞型別的指標(biāo)CD206表達上調(diào),M1型巨噬細胞TNFα表達下調(diào),代表巨噬細胞代謝水平的指標(biāo)i NOS表達降低,Arg-1表達升高,代表ROS水平DHE染色下降。直接共培養(yǎng)后的巨噬細胞MP-C較MB-C相比CD206、Arg-1表達較高,而i NOS、TNFα、DHE表達較低,表明PB-MSCs誘導(dǎo)巨噬細胞向M2方向的作用明顯強于BM-MSCs。結(jié)論:本研究成功的從動員的大鼠外周血中分離得到了具有典型形態(tài)特征、免疫表型、多向分化潛能的MSCs細胞。PB-MSCs與BM-MSCs相比分化能力減弱,但在炎癥因子表達譜、對巨噬細胞向M2型方向極化和重編程上卻表現(xiàn)出更強的能力。本研究的結(jié)果證實了PB-MSCs改變巨噬細胞的炎癥型別與細胞因子分泌和直接接觸發(fā)生重編程有關(guān),意味著PB-MSCs與BM-MSCs相比可能更適合于脊髓損傷(SCI)等疾病的抗炎治療。
【關(guān)鍵詞】：外周血間充質(zhì)干細胞 巨噬細胞 極化 重編程
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R651.2
【目錄】：

• 中英縮略詞對照表4-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-14
• 材料與方法14-31
• 結(jié)果31-41
• 討論41-44
• 結(jié)論44-45
• 參考文獻45-48
• 綜述48-55
• 參考文獻51-55
• 致謝55-56
• 作者簡介56

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1 ;豚鼠巨噬細胞經(jīng)P_(204)處理后的抗石英細胞毒作用[J];國外醫(yī)學(xué)參考資料(衛(wèi)生學(xué)分冊);1976年04期

2 鄧俠進;;巨噬細胞的抗癌作用[J];遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報;1979年02期

3 陸天才;;疾病對肺巨噬細胞的影響[J];煤礦醫(yī)學(xué);1982年01期

4 郭瑞清;祝彼得;;一種分離巨噬細胞的簡單方法[J];濱州醫(yī)學(xué)院學(xué)報;1990年02期

5 謝志堅;巨噬細胞異質(zhì)性[J];醫(yī)學(xué)綜述;2001年06期

6 饒艷;運動及神經(jīng)內(nèi)分泌對巨噬細胞功能的調(diào)節(jié)[J];體育與科學(xué);2002年05期

7 朱金元;;吸煙對肺巨噬細胞的影響[J];浙江醫(yī)學(xué)教育;2003年01期

8 張俊峰;過氧化物酶體增殖物激活受體與單核/巨噬細胞系[J];醫(yī)學(xué)綜述;2004年03期

9 韋錦學(xué);顧軍;;巨噬細胞的激活誘導(dǎo)死亡[J];生命科學(xué);2006年02期

10 李曉曦;郭寧;曹雪濤;;腫瘤相關(guān)巨噬細胞促進腫瘤生長與轉(zhuǎn)移的研究現(xiàn)狀[J];中國腫瘤生物治療雜志;2008年01期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 史玉玲;王又明;豐美福;;巨噬細胞激活作用的研究[A];中國細胞生物學(xué)學(xué)會第五次會議論文摘要匯編[C];1992年

2 吳國明;周輝;;巨噬細胞和創(chuàng)傷纖維化[A];2009年浙江省骨科學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2009年

3 李奇;王海杰;;透明質(zhì)酸對于淋巴結(jié)巨噬細胞運動的影響[A];解剖學(xué)雜志——中國解剖學(xué)會2002年年會文摘匯編[C];2002年

4 劉革修;歐大明;劉軍花;黃紅林;廖端芳;;丙丁酚在體外能抑制巨噬細胞脂質(zhì)氧化介導(dǎo)的低密度脂蛋白氧化并調(diào)節(jié)氧化巨噬細胞的分泌功能[A];面向21世紀(jì)的科技進步與社會經(jīng)濟發(fā)展（下冊）[C];1999年

5 葉金善;楊麗霞;郭瑞威;;環(huán)氧化酶-2/前列腺素E_2在血管緊張素Ⅱ刺激巨噬細胞表達細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子中的作用[A];第十三次全國心血管病學(xué)術(shù)會議論文集[C];2011年

6 秦帥;陳希;孔德明;;構(gòu)建由綠色熒光標(biāo)記巨噬細胞的轉(zhuǎn)基因斑馬魚系[A];貴州省中西醫(yī)結(jié)合內(nèi)分泌代謝學(xué)術(shù)會論文匯編[C];2012年

7 武劍華;徐惠綿;;腫瘤相關(guān)巨噬細胞在胃癌中的相關(guān)研究[A];第9屆全國胃癌學(xué)術(shù)會議暨第二屆陽光長城腫瘤學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2014年

8 何軍;;血凝素樣氧化型低密度脂蛋白受體升高巨噬細胞內(nèi)膽固醇水平[A];中華醫(yī)學(xué)會第11次心血管病學(xué)術(shù)會議論文摘要集[C];2009年

9 宋盛;周非凡;邢達;;PDT誘導(dǎo)的凋亡細胞對巨噬細胞NO合成的影響[A];第七屆全國光生物學(xué)學(xué)術(shù)會議論文摘要集[C];2010年

10 張磊;朱建華;黃元偉;姚航平;;血管緊張素Ⅱ?qū)奘杉毎?THP-1重細胞)凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體表達的影響[A];浙江省免疫學(xué)會第五次學(xué)術(shù)研討會論文匯編[C];2004年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 通訊員 李靜 記者 胡德榮;惡性腫瘤巨噬細胞未必皆“惡人”[N];健康報;2014年

2 蘭克;以嘗試用巨噬細胞治癱瘓[N];科技日報;2000年

3 薛佳;免疫系統(tǒng)——人體的“衛(wèi)士”[N];保健時報;2009年

4 記者 胡德榮;鐵泵蛋白“維穩(wěn)”鐵代謝作用首次闡明[N];健康報;2011年

5 侯嘉 何新鄉(xiāng);硒的神奇功能[N];中國食品質(zhì)量報;2003年

6 唐穎 倪兵 陳代杰;巨噬細胞泡沫化抑制劑研究快步進行[N];中國醫(yī)藥報;2006年

7 劉元江;新發(fā)現(xiàn)解釋腫瘤為何易成“漏網(wǎng)之魚”[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2007年

8 本報記者 侯嘉 通訊員 何新鄉(xiāng);今天你補硒了嗎[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2003年

9 左志剛;升血小板藥使用注意[N];醫(yī)藥養(yǎng)生保健報;2007年

10 記者 許琦敏;“鐵泵”蛋白幫助回收鐵元素[N];文匯報;2011年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 周赤燕;巨噬細胞MsrA對動脈粥樣硬化的干預(yù)研究[D];武漢大學(xué);2013年

2 章桂忠;TIPE2蛋白調(diào)控細胞增殖和炎癥的機制研究[D];山東大學(xué);2015年

3 張瑜;DKK1抑制巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積及其相關(guān)分子機制[D];山東大學(xué);2015年

4 孟濤;異丙酚對心臟收縮功能的抑制作用及其對巨噬細胞分泌功能調(diào)節(jié)的機制研究[D];山東大學(xué);2015年

5 周興;基于酵母微囊構(gòu)建新型口服巨噬細胞靶向遞送系統(tǒng)的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

6 蔣興偉;Tim-3對巨噬細胞極化的調(diào)控機制研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2015年

7 劉伯玉;清道夫受體A介導(dǎo)小鼠巨噬細胞吞噬鉤端螺旋體研究[D];上海交通大學(xué);2013年

8 楊紹俊;miRNA-155介導(dǎo)ESAT-6誘導(dǎo)巨噬細胞凋亡的分子機制及其在結(jié)核診斷中的作用[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

9 翟光耀;單核/巨噬細胞Ly6C~(low)亞群在心肌梗死后瘢痕形成期的抗炎特性研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2014年

10 韓露;TRB3介導(dǎo)的脂肪組織巨噬細胞極化與糖尿病冠狀動脈病變關(guān)系的研究[D];山東大學(xué);2015年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 馬春梅;AP0E~(-/-)小鼠TLR9介導(dǎo)巨噬細胞極化效應(yīng)對動脈粥樣硬化作用的研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

2 張譯丹;鹽皮質(zhì)激素受體拮抗劑調(diào)控巨噬細胞表型對實驗性矽肺的作用[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

3 盧文冉;HCV core蛋白作用的巨噬細胞培養(yǎng)上清對肝細胞生物學(xué)性狀的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

4 李文建;載脂蛋白E影響巨噬細胞因子表達及分型的機制研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

5 曹爽;高糖對巨噬細胞TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)作用[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

6 寧程程;腫瘤相關(guān)巨噬細胞在子宮內(nèi)膜癌雌激素敏感性中的作用及機制研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

7 高龍;PLD4在腫瘤相關(guān)巨噬細胞抑制結(jié)腸癌增殖中的作用研究[D];成都醫(yī)學(xué)院;2015年

8 任虹;感染期子宮頸癌U14細胞荷瘤小鼠抑制巨噬細胞CCL5分泌的機制研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

9 李美玲;雙酚A對小鼠腹腔巨噬細胞極化影響的體外研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年

10 劉瓊;黃芪多糖影響巨噬細胞向脂肪細胞趨化的作用及機制研究[D];新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院;2015年

  本文關(guān)鍵詞：外周血間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)巨噬細胞極化與重編程的體外研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：360150