發(fā)布時(shí)間：2022-01-04 00:18

　　目的構(gòu)建熱激啟動(dòng)子（p HSP,HSP Promoter）驅(qū)動(dòng)的靶向敲低Polo樣蛋白激酶1（PLK1）的真核表達(dá)質(zhì)粒,并觀察其對(duì)骨肉瘤U2OS細(xì)胞增殖的影響。方法首先合成熱休克蛋白HSP70的啟動(dòng)子,克隆至帶有綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)簽的真核表達(dá)質(zhì)粒p EGFP-C1中,利用熱激啟動(dòng)子（p HSP）替換原有的CMV啟動(dòng)子,構(gòu)建真核表達(dá)載體p HSP-GFP;其次,利用RNA干擾技術(shù)合成以PLK1基因?yàn)榘邢蚰繕?biāo)的sh RNA,將其定向克隆至真核表達(dá)載體p HSP-GFP中形成重組質(zhì)粒p HSP-sh PLK1-GFP;另外設(shè)計(jì)一組陰性對(duì)照質(zhì)粒p HSP-NC-GFP,最后,利用脂質(zhì)體Lipo2000轉(zhuǎn)染的方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至U2OS細(xì)胞,非熱激組細(xì)胞正常培養(yǎng),熱激組及陰性對(duì)照組細(xì)胞42℃加熱2h,通過細(xì)胞免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GFP的表達(dá),從而確定熱激啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)能力,采用Quantitative real-time PCR的方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PLK1的m RNA表達(dá)水平,Western blotting技術(shù)檢測(cè)PLK1蛋白表達(dá)水平,利用MTT法檢測(cè)重組質(zhì)粒對(duì)U2OS細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果成功構(gòu)建... 

【文章來(lái)源】：安徽醫(yī)科大學(xué)安徽省

【文章頁(yè)數(shù)】：58 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

熱激啟動(dòng)子（pHSP）序列設(shè)計(jì)結(jié)果

重組質(zhì)粒pHSP-shPlk1-GFP的測(cè)序結(jié)果

重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：3567264