目的 探究機(jī)械敏感離子通路Piezo1是否通過(guò)調(diào)控驅(qū)動(dòng)蛋白Kif18A表達(dá)改變細(xì)胞骨架蛋白進(jìn)而影響細(xì)胞的分裂增殖。方法 制備干擾Piezo1表達(dá)的FAM38A-sh RNA慢病毒載體,體外轉(zhuǎn)染骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨細(xì)胞,篩選有效干擾Piezo1表達(dá)的序列作為慢病毒載體干擾組（C組）,同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組（A組）、慢病毒空載體組（B組）、慢病毒干擾序列（LV3-Pie zo1-homo-3201）組（C組）、Kif18A藥物阻斷組（D組）、慢病毒干擾序列（LV3-Piezo1-homo-3201）+Kif18A藥物阻斷組（E組）。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)獲得的預(yù)知結(jié)果用多通道細(xì)胞機(jī)械牽張應(yīng)力加載系統(tǒng)FX-4000T分別周期作用各組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞組0h、2h、12 h、24 h、48 h。在光學(xué)顯微鏡下在不同時(shí)間觀察細(xì)胞形態(tài)變化,采用cck8試劑盒測(cè)定細(xì)胞增殖,RT-PCR和Western-Blot檢測(cè)相關(guān)基因Piezo1、β-tubulin、Ki f18A的轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯表達(dá)水平。結(jié)果 慢病毒干擾載體LV3-Piezo1-homo-3201序列組Piezo1目的基因相對(duì)表達(dá)量明顯下降,干擾效果顯著（P<0.0... 

【文章來(lái)源】：青島大學(xué)山東省

【文章頁(yè)數(shù)】：46 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

帶有ZsGreen熒光和puro抗性基因標(biāo)記h-PIEZO1干擾慢病毒載體

細(xì)胞多呈細(xì)長(zhǎng)梭形，排列緊密，部分細(xì)胞呈多角形，單核，個(gè)別細(xì)胞變修長(zhǎng)形并出現(xiàn)絲狀觸角，為老化現(xiàn)象。（圖2）。圖 2 倒置光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞的形態(tài)（100×），不同時(shí)間點(diǎn)下細(xì)胞數(shù)目和形態(tài)不同。數(shù)目不斷增長(zhǎng)，形態(tài)由多邊形向梭形變化。1.2 免疫組織化學(xué)染色免疫組織化學(xué)染色結(jié)果示軟骨細(xì)胞胞質(zhì)染成黃褐色，細(xì)胞核復(fù)染成藍(lán)色，表示軟骨細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有Ⅱ型膠原蛋白(圖 3)。

染色結(jié)果（200×），軟骨細(xì)胞胞質(zhì)染成黃褐色，細(xì)胞核復(fù)染成藍(lán)色藍(lán)染色甲苯胺藍(lán)染色來(lái)鑒別軟骨細(xì)胞，因存在于軟骨細(xì)胞的蛋白多料甲苯胺藍(lán)染成藍(lán)紫色，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)軟骨細(xì)胞胞質(zhì)呈紫 4），可知軟骨細(xì)胞產(chǎn)生蛋白多糖。


本文編號(hào)：3519975