第一部分:p GFP/h TERT/Neo轉(zhuǎn)染正常人椎間盤髓核細(xì)胞構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞目的:探討h TERT（人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因）重組綠色熒光表達(dá)載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)染正常髓核細(xì)胞構(gòu)建永生化細(xì)胞的可行性,為進(jìn)一步探討人椎間盤髓核細(xì)胞退變機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究提供標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞株。方法:通過目的基因克隆、真核表達(dá)質(zhì)粒中目的基因序列測(cè)定、目的基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染h TERT表達(dá)檢測(cè)等步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。XTT方法檢測(cè)正常髓核細(xì)胞與轉(zhuǎn)染h TERT髓核細(xì)胞生長曲線,RT-PCR檢測(cè)兩種細(xì)胞Ⅱ型膠原、糖胺多糖、BMP-2、IGF-1、TGF-β、BMP-4、COLLAGEN I、PDGF、FGF基因表達(dá)量,ELISA方法檢測(cè)兩種細(xì)胞外液Ⅱ型膠原、糖胺多糖表達(dá)量,無血清培養(yǎng)基狀態(tài)下細(xì)胞周期分析檢測(cè)細(xì)胞凋亡,裸小鼠種植實(shí)驗(yàn)檢測(cè)永生化髓核細(xì)胞的致瘤性實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行病理分析。結(jié)果:轉(zhuǎn)染hTERT后NP細(xì)胞增殖加速,傳了20代細(xì)胞仍未見老化,細(xì)胞內(nèi)Ⅱ型膠原、糖胺多糖基因表達(dá)與正常髓核細(xì)胞第1代類似,細(xì)胞外液Ⅱ型膠原、糖胺多糖與正常髓核細(xì)胞第1代類似。而未轉(zhuǎn)染h TERT的NP細(xì)胞傳4⁵代增值基本停滯了。細(xì)胞... 

【文章來源】：暨南大學(xué)廣東省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：84 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

pGFP/hTERT/Neo構(gòu)建示意圖

的基因 hTERT 片段的結(jié)果，PCR 擴(kuò)產(chǎn)物為 1.9 kb 和 1.4kb, 與預(yù)期結(jié) amplified fragment of hTERT gene.1 2 3 4 5 6RT 鑒定結(jié)果,質(zhì)粒pEGFP-hTERT經(jīng)過果一致。1-λHindIII. 2-6. pEGF pEGFP/hTERT gene.1 2 3 4

2.3kb1 2 3 4 5 6圖3. 重組克隆pEGFP/hTERT 鑒定結(jié)果,質(zhì)粒pEGFP-hTERT經(jīng)過BamH1酶切后證實(shí)目的基因在3kb，與預(yù)期結(jié)果一致。1-λHindIII. 2-6. pEGFP-hTERT 酶切結(jié)果。Fig.3. RT-PCR analyzed the pEGFP/hTERT gene.1 2 3 41.5kb400bp圖 4. 轉(zhuǎn)染 pEGFP- hTERT 后髓核細(xì)胞 hTERT 表達(dá)情況。質(zhì)粒 pEGFP- hTERT 轉(zhuǎn)染細(xì)胞后經(jīng)過 RT-PCR 證實(shí)目的產(chǎn)物在 1.5kb，引用 RT-3 和 RT-4 兩對(duì)引物完成，內(nèi)參在 370bp，與預(yù)期的一致。1-marker. 2-陰性對(duì)照組。3-細(xì)胞轉(zhuǎn)染后 24h。4-細(xì)胞轉(zhuǎn)染后 72h。Fig.3. RT-PCR analyzed the hTERT gene.

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]椎間盤退變對(duì)L4-L5在垂直載荷下生物力學(xué)行為特性的影響[J]. 胡迎春,歐亞龍,胡裔志,余兵浩.  生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志. 2015(01)
[2]Immortalization of human umbilical vein endothelial cells with telomerase reverse transcriptase and simian virus 40 large T antigen[J]. 邊昶,趙葵,童國新,朱永良,陳鵬.  Journal of Zhejiang University Science. 2005(07)



本文編號(hào)：3500056