第一部分:p GFP/h TERT/Neo轉染正常人椎間盤髓核細胞構建穩(wěn)定細胞目的:探討h TERT（人端粒酶逆轉錄酶基因）重組綠色熒光表達載體的構建及其轉染正常髓核細胞構建永生化細胞的可行性,為進一步探討人椎間盤髓核細胞退變機制的實驗研究提供標準細胞株。方法:通過目的基因克隆、真核表達質粒中目的基因序列測定、目的基因真核表達質粒的構建、轉染h TERT表達檢測等步驟進行實驗。XTT方法檢測正常髓核細胞與轉染h TERT髓核細胞生長曲線,RT-PCR檢測兩種細胞Ⅱ型膠原、糖胺多糖、BMP-2、IGF-1、TGF-β、BMP-4、COLLAGEN I、PDGF、FGF基因表達量,ELISA方法檢測兩種細胞外液Ⅱ型膠原、糖胺多糖表達量,無血清培養(yǎng)基狀態(tài)下細胞周期分析檢測細胞凋亡,裸小鼠種植實驗檢測永生化髓核細胞的致瘤性實驗并進行病理分析。結果:轉染hTERT后NP細胞增殖加速,傳了20代細胞仍未見老化,細胞內Ⅱ型膠原、糖胺多糖基因表達與正常髓核細胞第1代類似,細胞外液Ⅱ型膠原、糖胺多糖與正常髓核細胞第1代類似。而未轉染h TERT的NP細胞傳4⁵代增值基本停滯了。細胞... 

【文章來源】：暨南大學廣東省 211工程院校

【文章頁數】：84 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

pGFP/hTERT/Neo構建示意圖

的基因 hTERT 片段的結果，PCR 擴產物為 1.9 kb 和 1.4kb, 與預期結 amplified fragment of hTERT gene.1 2 3 4 5 6RT 鑒定結果,質粒pEGFP-hTERT經過果一致。1-λHindIII. 2-6. pEGF pEGFP/hTERT gene.1 2 3 4

2.3kb1 2 3 4 5 6圖3. 重組克隆pEGFP/hTERT 鑒定結果,質粒pEGFP-hTERT經過BamH1酶切后證實目的基因在3kb，與預期結果一致。1-λHindIII. 2-6. pEGFP-hTERT 酶切結果。Fig.3. RT-PCR analyzed the pEGFP/hTERT gene.1 2 3 41.5kb400bp圖 4. 轉染 pEGFP- hTERT 后髓核細胞 hTERT 表達情況。質粒 pEGFP- hTERT 轉染細胞后經過 RT-PCR 證實目的產物在 1.5kb，引用 RT-3 和 RT-4 兩對引物完成，內參在 370bp，與預期的一致。1-marker. 2-陰性對照組。3-細胞轉染后 24h。4-細胞轉染后 72h。Fig.3. RT-PCR analyzed the hTERT gene.

【參考文獻】：
期刊論文
[1]椎間盤退變對L4-L5在垂直載荷下生物力學行為特性的影響[J]. 胡迎春,歐亞龍,胡裔志,余兵浩.  生物醫(yī)學工程學雜志. 2015(01)
[2]Immortalization of human umbilical vein endothelial cells with telomerase reverse transcriptase and simian virus 40 large T antigen[J]. 邊昶,趙葵,童國新,朱永良,陳鵬.  Journal of Zhejiang University Science. 2005(07)



本文編號：3500056