[目 的]通過構(gòu)建CaMKIIγ慢病毒并轉(zhuǎn)染穩(wěn)定傳代的大鼠肝細胞BRL-3 A,探究CaMKIIγ表達水平對大鼠肝細胞BRL-3A增殖的影響。[方 法]通過體外培養(yǎng)穩(wěn)定傳代的大鼠肝細胞BRL-3A系,構(gòu)建CaMKIIγ過表達（LV-CaMKIIγ）、敲低（LV-CaMKIIγ shRNA）及相應空白載體的慢病毒體系,分別轉(zhuǎn)染入大鼠肝細胞BRL-3A內(nèi)并建立空白對照組。然后通過流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率,采用QRT-PCR法檢測各組不同時間點的CaMKIIγ mRNA表達水平;Western blot法檢測CaMKIIγ蛋白在各組不同時間點的表達水平;CCK-8法檢測細胞生長情況并繪制生長曲線,用于檢測不同時間的細胞計數(shù);流式細胞儀法檢測各組不同時間點的細胞周期。[結(jié) 果]（1）各組慢病毒均成功轉(zhuǎn)染入大鼠肝細胞BRL-3A內(nèi);（2）應用QRT-PCR檢測結(jié)果:感染后第1天,LV-CaMKIIγ組與CON組CaMKIIγmRNA相對表達量差異有意義（P<0.01）,LV-CaMKIIγ shRNA組與CON組無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。感染后第 3 天、5 天、7 天,LV-Ca... 

【文章來源】：昆明醫(yī)科大學云南省

【文章頁數(shù)】：62 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖２?ＣａＭＫＩＩｙ目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染２９３Ｔ細胞??

ＣａＭＫＩＩｙ過表達病毒ＬＶ－ＣａＭＫ２ｇ可感染２９３Ｔ細胞，并達到滿意的表達ＣａＭＫＩｌｙ??效果。??（８）慢病毒滴度：??ＩＤ?Ｔｉｔｅｒ?（ＴＵ／ｍｌ）??ＬＶ－Ｃａｍｋ２ｇ（４２６３６－４）?２Ｅ＋９??陰性對照ＣＯＮ３３５?２Ｅ＋９??２．３．２?ＣａＭＫＩＩｙ?ｓｈＲＮＡ?慢病毒?ＬＶ－ＣａＭＫＩＩｙ?ｓｈＲＮＡ?信息??（１）?ＣａＭＫＪＩｙｓｈＲＮＡ?設(shè)計??Ｔａｒｇｅｔ?Ｓｅｑ?ＧＣ％??ＧＧＡＧＡＧＣＧＴＣＡＡＣＣＡＣＡＴＣ?５７．８９％??（２）基本信息??載體名稱：ＧＶ４９３??元件順序：ｈＵ６－ＭＣＳ－ＣＢｈ－ｇｃＧＦＰ－ＩＲＥＳ－ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ??對照編號：ＣＯＮ３１３??對照插入序列：丁?ＴＣＴＣＣＧＡＡＣＧＴＧＴＣＡＣＧＴ??Ｉｆ?ＧＶ４９３?Ｔ．－＾１??＞?中?ＭＣＳ??ｎ??圖３?ＧＶ４９３載體圖譜??（３）?ｏｌｉｇｏ合成信息：??１７??

２．９統(tǒng)計學分析??所有實驗數(shù)據(jù)均使用ＳＰＳＳ１９．０進行統(tǒng)計學分析，測量數(shù)據(jù)表示為平均值士??標準差（３ｆ±ｓ），首先進行方差的齊性檢驗以確定方差齊同，組間比較采用單因??素方差分析，兩兩比較采用ＬＳＤ＿ｔ檢驗，檢驗水準ａ＝０．０５。采用ＧｒａｐｈＰｓｄＰｒｉｓｍ??５．０軟件進行作圖。??結(jié)果??１慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠肝細胞ＢＲＬ－３Ａ情況??根據(jù)慢病毒感染大鼠肝細胞ＢＲＬ－３Ａ預實驗確定的ＭＯＩ和感染條件后，進??行慢病毒感染大鼠肝細胞ＢＲＬ－３Ａ的正式實驗，在完成感染實驗步驟后，通過熒??光倒置顯微鏡，觀察到靶基因熒光蛋白的表達，表明靶基因進入大鼠肝細胞??ＢＲＬ－３Ａ，并通過流式細胞儀檢測，各組慢病毒感染效率在６０％以上。??■ＩＢ??Ｂ??焚光倒置顯微鏡下成像（ｌ〇〇ｘ）?倒置顯微鏡下成像（１００Ｘ）??圖４?ＬＶ－ＣａＭＫＩＩＹ組慢病毒感染細胞７２小時后綠色熒光的表達??ＨＭ??熒光倒置顯微鏡下成像（１００Ｘ）?倒置顯微鏡下成像（１００Ｘ）??圖５?ＬＶ－ＣａＭＫＩＩＹ－ＮＣ組慢病毒感染細胞７２小時后綠色熒光的表達??３０??


本文編號：3132913