實驗目的骨骼肌損傷后修復是運動醫(yī)學研究的熱點問題,骨骼肌具有很強的再生能力以應對輕微損傷,但嚴重損傷可導致廣泛且不可逆的纖維化,瘢痕形成和肌肉功能喪失。如何提高骨骼肌損傷后的再生修復能力,促使病人盡早康復仍是研究的難點。因此,研究骨骼肌再生修復機制,可以為骨骼肌損傷修復提供理論基礎,有助于臨床骨骼肌損傷的治療。本課題主要利用CRISPR/Cas9技術構建穩(wěn)定敲除LRTM1（Leucine-rich repeats and transmenbrane domains 1）基因的C2C12細胞系,研究Lrtm1對C2C12細胞成肌分化的作用及作用機制。研究方法利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)將C2C12細胞中LRTM1基因穩(wěn)定敲除,挑選敲除LRTM1的單克隆細胞,構建穩(wěn)定敲除LRTM1的C2C12細胞株;誘導敲除LRTM1穩(wěn)定細胞株成肌分化,Western blot和RT-PCR檢測成肌分化標志因子Myosin和MyoG的表達;CCK8實驗檢測細胞敲除LRTM1后細胞的增殖情況;Western blot檢測敲除LRTM1后C2C12細胞中p-ERK水平,以及ERK下游CyclinD1/CDK... 

【文章來源】：重慶醫(yī)科大學重慶市

【文章頁數(shù)】：46 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

成肌分化96小時細胞融合Fig.1Myoblastfusionafterdifferentiation96hours

化過程中的作用。我們首先構建了 C2C12 細與 6 孔板，當細胞密度達到 80%時更換分融合（圖 1）。并且 Western blot 檢測成表達（圖 2），可以見隨分化時間延長，成肌分化體系建立成功。圖 1 成肌分化 96 小時細胞融合Fig.1 Myoblast fusion after differentiation 96 h

圖 3 商品化抗體 LRTM1 的可疑條帶位置Fig.3 Suspected band position of LRTM1 commercial anTM1 siRNA 效果驗證加入 siRNA 后LRTM1 條帶不變的原因是否為 LR在 C2C12 細胞中瞬時過表達 LRTM1，并轉入 siR性 LRTM1 的表達，從而確定 LRTM1-siRNA 的效NA 干擾組外源性 LRTM1 成功表達，但轉入 si-L有表達，并且同時轉入的 GFP 能夠表達，證明轉染TM1 能成功抑制 LRTM1 的表達，所以商品化抗帶，商品化不能特異性識別 LRTM1。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]Lrtm1基因在成肌分化過程中的功能探索[J]. 熊雷,李浩可,聶茂,鄧忠良.  重慶醫(yī)科大學學報. 2018(10)



本文編號：3035046