實(shí)驗(yàn)?zāi)康墓趋兰p傷后修復(fù)是運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題,骨骼肌具有很強(qiáng)的再生能力以應(yīng)對(duì)輕微損傷,但嚴(yán)重?fù)p傷可導(dǎo)致廣泛且不可逆的纖維化,瘢痕形成和肌肉功能喪失。如何提高骨骼肌損傷后的再生修復(fù)能力,促使病人盡早康復(fù)仍是研究的難點(diǎn)。因此,研究骨骼肌再生修復(fù)機(jī)制,可以為骨骼肌損傷修復(fù)提供理論基礎(chǔ),有助于臨床骨骼肌損傷的治療。本課題主要利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定敲除LRTM1（Leucine-rich repeats and transmenbrane domains 1）基因的C2C12細(xì)胞系,研究Lrtm1對(duì)C2C12細(xì)胞成肌分化的作用及作用機(jī)制。研究方法利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)將C2C12細(xì)胞中LRTM1基因穩(wěn)定敲除,挑選敲除LRTM1的單克隆細(xì)胞,構(gòu)建穩(wěn)定敲除LRTM1的C2C12細(xì)胞株;誘導(dǎo)敲除LRTM1穩(wěn)定細(xì)胞株成肌分化,Western blot和RT-PCR檢測(cè)成肌分化標(biāo)志因子Myosin和MyoG的表達(dá);CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞敲除LRTM1后細(xì)胞的增殖情況;Western blot檢測(cè)敲除LRTM1后C2C12細(xì)胞中p-ERK水平,以及ERK下游CyclinD1/CDK... 

【文章來(lái)源】：重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市

【文章頁(yè)數(shù)】：46 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

成肌分化96小時(shí)細(xì)胞融合Fig.1Myoblastfusionafterdifferentiation96hours

化過(guò)程中的作用。我們首先構(gòu)建了 C2C12 細(xì)與 6 孔板，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到 80%時(shí)更換分融合（圖 1）。并且 Western blot 檢測(cè)成表達(dá)（圖 2），可以見(jiàn)隨分化時(shí)間延長(zhǎng)，成肌分化體系建立成功。圖 1 成肌分化 96 小時(shí)細(xì)胞融合Fig.1 Myoblast fusion after differentiation 96 h

圖 3 商品化抗體 LRTM1 的可疑條帶位置Fig.3 Suspected band position of LRTM1 commercial anTM1 siRNA 效果驗(yàn)證加入 siRNA 后LRTM1 條帶不變的原因是否為 LR在 C2C12 細(xì)胞中瞬時(shí)過(guò)表達(dá) LRTM1，并轉(zhuǎn)入 siR性 LRTM1 的表達(dá)，從而確定 LRTM1-siRNA 的效NA 干擾組外源性 LRTM1 成功表達(dá)，但轉(zhuǎn)入 si-L有表達(dá)，并且同時(shí)轉(zhuǎn)入的 GFP 能夠表達(dá)，證明轉(zhuǎn)染TM1 能成功抑制 LRTM1 的表達(dá)，所以商品化抗帶，商品化不能特異性識(shí)別 LRTM1。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Lrtm1基因在成肌分化過(guò)程中的功能探索[J]. 熊雷,李浩可,聶茂,鄧忠良.  重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 2018(10)



本文編號(hào)：3035046