本文關(guān)鍵詞：MiR-27b通過PPAR-γ抑制軟骨細(xì)胞肥大化作用的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：脊椎動(dòng)物骨骼的生長(zhǎng)發(fā)育主要是靠膜內(nèi)骨化和軟骨內(nèi)骨化完成的。其中,軟骨內(nèi)骨化主要發(fā)生在四肢骨和軀干骨等大部分骨骼元件中,是骨的發(fā)育和生長(zhǎng)階段中一個(gè)關(guān)鍵的生理過程。該過程起始于間充質(zhì)干細(xì)胞的凝集并分化形成軟骨細(xì)胞,隨后,軟骨細(xì)胞經(jīng)過增殖、成熟、肥大化的分化步驟分化為肥大化的軟骨細(xì)胞,再經(jīng)歷細(xì)胞凋亡、鈣化、血管入侵,破骨細(xì)胞和造骨細(xì)胞產(chǎn)生等一系列過程,最終以退化的軟骨基質(zhì)為構(gòu)架產(chǎn)生骨基質(zhì)。在某種情況下,軟骨細(xì)胞肥大化進(jìn)程發(fā)生異常,將發(fā)生由軟骨降解和結(jié)構(gòu)破壞、軟骨發(fā)育異常等原因引起的相關(guān)疾病,如,骨關(guān)節(jié)炎以及軟骨發(fā)育不全等。因此,深入研究軟骨細(xì)胞肥大化分子機(jī)制,對(duì)于軟骨細(xì)胞肥大化相關(guān)疾病的預(yù)防和治療具有重要意義。隨著micro RNAs(mi RNAs)在脊椎動(dòng)物軟骨發(fā)育中的作用被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道,在軟骨分化過程中的相關(guān)mi RNAs功能研究成為了骨關(guān)節(jié)炎與骨骼發(fā)育病理研究的一大熱點(diǎn)。本文旨在探究micro RNA-27b(mi R-27b)在軟骨細(xì)胞肥大化過程中的作用,并分析其通過靶基因之一過氧化物酶增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)在軟骨細(xì)胞肥大化過程中的調(diào)控機(jī)制。本研究以出生1-3天的大鼠乳鼠膝關(guān)節(jié)軟骨為研究對(duì)象,用免疫組化、RT-PCR的方法觀察正常軟骨細(xì)胞標(biāo)志物II型膠原(COL II)以及肥大化標(biāo)志物X型膠原(COL X)、MMP-13的表達(dá)情況以確定膝關(guān)節(jié)軟骨的靜止區(qū)、增殖區(qū)和肥大化區(qū),用原位雜交實(shí)驗(yàn)以及RT-q PCR檢測(cè)mi R-27b的分布情況。結(jié)合生物信息學(xué)網(wǎng)站、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)系統(tǒng)以及Western blot確定PPAR-γ為其靶基因之一。并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行mi R-27b過表達(dá)實(shí)驗(yàn),分為實(shí)驗(yàn)組(mi R-27b mimic)、陰性對(duì)照組(negative control)、和轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組(normal),分別從基因和蛋白水平證實(shí)mi R-27b對(duì)軟骨細(xì)胞肥大化的抑制作用。結(jié)果:1.形態(tài)學(xué)染色結(jié)果顯示,軟骨細(xì)胞柱狀排列,由關(guān)節(jié)表層至深層,體積逐漸增大,COL X表達(dá)增加。2.原位雜交結(jié)果顯示,mi R-27b主要表達(dá)在細(xì)胞核中,隨著軟骨細(xì)胞肥大化分化,其表達(dá)量逐漸下降。RT-q PCR結(jié)果顯示,與肥大化期軟骨細(xì)胞相比,靜止期軟骨細(xì)胞mi R-27b的表達(dá)高至6.2倍(P0.01)。3.通過生物信息學(xué)網(wǎng)站分析,確認(rèn)PPAR-γ3’-UTR序列上存在mi R-27b的結(jié)合位點(diǎn);雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí),在軟骨細(xì)胞中rno-mir-27b-3p對(duì)psi CHECK-PPAR-γ(p0.01)的熒光表達(dá)有顯著抑制作用。Western blot結(jié)果顯示,mi R-27b mimic轉(zhuǎn)染組,PPAR-γ2表達(dá)明顯下調(diào)。4.分離培養(yǎng)肥大化軟骨細(xì)胞,并對(duì)其進(jìn)行過表達(dá)干預(yù),同時(shí)用軟骨細(xì)胞肥大化誘導(dǎo)液繼續(xù)肥大化誘導(dǎo)。7天后,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均有油紅O染色陽性的脂滴出現(xiàn),實(shí)驗(yàn)組與轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比,脂滴數(shù)量明顯降低(P0.01)。5.RT-q PCR結(jié)果顯示,mi R-27b過表達(dá)以后,COL II、SOX-9表達(dá)增加(P0.01),MMP-13、PPAR-γ表達(dá)下降(P0.01);Western blot結(jié)果顯示,mi R-27b過表達(dá)以后,PPAR-γ2與COL X的蛋白表達(dá)明顯受到抑制。結(jié)論:1.Mi R-27b對(duì)軟骨細(xì)胞肥大化發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。2.提高mi R-27b的表達(dá)可以推遲軟骨細(xì)胞肥大化進(jìn)程。3.PPAR-γ是mi R-27b的靶基因之一,它可能通過某種機(jī)制正調(diào)控COL X的表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：軟骨細(xì)胞 肥大化 MiR-27b PPAR-γ
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R68
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第1章 緒論11-17
• 1.1 軟骨內(nèi)骨化11-13
• 1.1.1 軟骨內(nèi)骨化過程簡(jiǎn)介11-12
• 1.1.2 軟骨細(xì)胞肥大化過程的調(diào)控12-13
• 1.1.3 軟骨細(xì)胞肥大化異常引發(fā)的相關(guān)疾病13
• 1.2 MicroRNAs與軟骨發(fā)育13-16
• 1.2.1 MicroRNAs簡(jiǎn)介13-14
• 1.2.2 MiRNAs與軟骨發(fā)育調(diào)控14-15
• 1.2.3 MiR-27b與軟骨分化15-16
• 1.3 PPAR-γ 與軟骨分化16-17
• 第2章 材料與方法17-31
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料17-20
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備17-18
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑18-19
• 2.1.3 主要試劑的配制19-20
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物20
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法20-31
• 2.2.1 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織學(xué)染色20-21
• 2.2.2 原位雜交21-22
• 2.2.3 軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng)22
• 2.2.4 RT-PCR及RT-qPCR22-27
• 2.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)27-29
• 2.2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染29
• 2.2.7 Western blot29-30
• 2.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析30-31
• 第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果31-38
• 3.1 大乳鼠膝關(guān)節(jié)軟骨相關(guān)基因及miR-27b表達(dá)情況31-33
• 3.1.1 大乳鼠膝關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)學(xué)特點(diǎn)31
• 3.1.2 大乳鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織相關(guān)基因表達(dá)情況31-32
• 3.1.3 大乳鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織miR-27b表達(dá)及分布情況32-33
• 3.2 MiR-27b靶點(diǎn)預(yù)測(cè)33-34
• 3.2.1 MiR-27b靶點(diǎn)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)33
• 3.2.2 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)33-34
• 3.3 Mi R-27b過表達(dá)干預(yù)實(shí)驗(yàn)34-38
• 3.3.1 Mimics最佳轉(zhuǎn)染濃度篩選34-35
• 3.3.2 上調(diào)miR-27b后軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)分化現(xiàn)象35-36
• 3.3.3 上調(diào)miR-27b對(duì)肥大化軟骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響36-37
• 3.3.4 上調(diào)miR-27b對(duì)肥大化軟骨細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響37-38
• 第4章 討論38-43
• 第5章 結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-50
• 作者簡(jiǎn)介和科研成果50-51
• 致謝51

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本文編號(hào)：300860