目的:近些年來神經(jīng)干細(xì)胞研究成為治療諸如脊髓損傷等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的熱點(diǎn)手段,而該治療手段中調(diào)控和提高神經(jīng)干細(xì)胞的增殖至關(guān)重要,本課題旨在研究EZH2基因?qū)w外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響,并探究其潛在作用機(jī)制,擬為臨床細(xì)胞學(xué)治療脊髓損傷及相關(guān)疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:選取第3-6代正常人神經(jīng)干細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象。首先分別利用慢病毒構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株:EZH2基因過表達(dá)細(xì)胞（OV-EZH2）及其對照細(xì)胞（OV-Control）、EZH2基因shRNA敲降細(xì)胞（sh-EZH2）及其對照細(xì)胞（sh-Control）,并采用免疫熒光,western blot和real-time PCR多種手段鑒定穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建成功;其次通過CCK-8方法檢測三個(gè)時(shí)間點(diǎn)下EZH2對神經(jīng)干細(xì)胞的活性的影響,同時(shí)采用EdU染色法檢測三個(gè)時(shí)間點(diǎn)下EZH2對神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力的影響;再次,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測四種細(xì)胞細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡率的變化情況;最后,western blot和real-time PCR方法檢測調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白G1/S-特異性周期蛋白CyclinD1和增殖相關(guān)蛋白c-Myc在蛋白和mRNA... 

【文章來源】：桂林醫(yī)學(xué)院廣西壯族自治區(qū)

【文章頁數(shù)】：52 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

EZH2基因過表達(dá)和敲降細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)構(gòu)建鑒定

S 期和 G2 期細(xì)胞數(shù)量代表著細(xì)胞增殖期細(xì)胞數(shù)量，為了研究 EZH2基因在神經(jīng)干細(xì)胞增殖中具體的作用方式，研究利用細(xì)胞周期檢測試劑盒對神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞周期各時(shí)期細(xì)胞比例進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相較于基因敲降陰性對照組（sh-Control），EZH2 干擾（sh-EZH2）組細(xì)胞處于G1 期細(xì)胞數(shù)量比例顯著上調(diào)（圖 3、表 1，P＜0.05），而 S 期和 G2 期細(xì)胞數(shù)量比例顯著降低（圖 3、表 1，P＜0.05），說明 EZH2 基因表達(dá)受到抑制之后，細(xì)胞被阻滯在 G1 期，進(jìn)而造成了神經(jīng)干細(xì)胞自我更新的抑制。反過來，研究中利用慢病毒對 EZH2 基因進(jìn)行過表達(dá)，相較于對照組（OV-Control），在神經(jīng)干細(xì)胞中 EZH2 過表達(dá)后(OV-EZH2)，細(xì)胞處于G1 期細(xì)胞數(shù)量比例顯著下降（圖 3、表 1，P＜0.05），而 S 期和 G2 期細(xì)胞數(shù)量比例顯著上升（圖 3、表 1，P＜0.05），證明 EZH2 基因能夠促進(jìn)細(xì)胞從 G1 期加速進(jìn)入細(xì)胞周期 S 期和 G2 期從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。

OV-EZH2 68.09±0.88*19.28±1.20*11.59±1.42*F 4.87 5.76 7.48*P ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05sh-Control 78.24±1.36 11.49±0.81 6.82±0.53sh-EZH2 89.19±0.98#5.00±0.62#2.86±0.43#F 1.71 4.76 4.83#P ＜0.05 ＜0.05 ＜0.052.4 體外過表達(dá)或沉默 EZH2 對神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的影響細(xì)胞增殖和凋亡是細(xì)胞自我更新兩個(gè)相反而又統(tǒng)一的兩個(gè)方向，前研究發(fā)現(xiàn) EZH2 能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞周期，同時(shí)又能增加細(xì)胞數(shù)量為了研究 EZH2 對細(xì)胞凋亡是否產(chǎn)生影響，研究采取流式細(xì)胞凋亡檢測劑盒，對細(xì)胞凋亡水平進(jìn)行分析。研究結(jié)果顯示，EZH2 干擾組和 EZH表達(dá)組與其各自對照組相比，細(xì)胞凋亡水平均未有顯著差異（圖 4、表

【參考文獻(xiàn)】：
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碩士論文
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本文編號：2974636