研究背景骨性關(guān)節(jié)炎是一種常見的關(guān)節(jié)疾病,好發(fā)于60歲以上老年人。有文獻(xiàn)指出,全球大約15%的人口都受到骨性關(guān)節(jié)炎的困擾�；谖覈餍胁W(xué)調(diào)查的結(jié)果顯示,我國大約4%的人口都被診斷為骨性關(guān)節(jié)炎,在60歲以上的人口中,這一比例甚至高達(dá)42.8%。隨著我國人口老齡化現(xiàn)狀的加劇,可以預(yù)計(jì),在未來的幾十年,罹患骨性關(guān)節(jié)炎的人數(shù)會(huì)越來越高。但是針對骨性關(guān)節(jié)炎的治療一直以來缺少有效的藥物。在疾病發(fā)展早期,主要以關(guān)節(jié)疼痛為主要癥狀,所以一般采用止痛等對癥治療。隨著疾病的進(jìn)展,會(huì)逐漸出現(xiàn)活動(dòng)障礙甚至致殘,此時(shí)只有通過關(guān)節(jié)置換術(shù)才能進(jìn)行治療。這就意味著患者需要承擔(dān)更多的痛苦,耗費(fèi)更多的資金。一直以來,多國的專家學(xué)者進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn),試圖尋找到一種能夠延緩甚至治愈骨性關(guān)節(jié)炎的藥物。雖然耗費(fèi)了大量的時(shí)間和資金,但是到目前為止,尚未找到一種能夠?qū)崿F(xiàn)上述目標(biāo)的藥物。如果研發(fā)一種新型的可以應(yīng)用于臨床的藥物,往往需要大量資源,據(jù)統(tǒng)計(jì),需要平均耗費(fèi)幾十億美元和十幾年時(shí)間。本課題組結(jié)合這一實(shí)際情況,試圖從目前美國FDA(Food and Drug Administration)批準(zhǔn)的已經(jīng)在臨床應(yīng)用的藥物庫里,找到一種能夠?qū)崿F(xiàn)上述目標(biāo)的藥物。相比關(guān)節(jié)腔注射藥物治療來說,口服藥物具有應(yīng)用簡單、攜帶方便、無創(chuàng)治療等優(yōu)點(diǎn)。所以,如果我們能夠找到一種能夠直接口服的藥物,并且該藥物具有緩解甚至治愈骨性關(guān)節(jié)炎的作用,這無疑減輕了患者在治療時(shí)的痛苦,在生活中也提供了很多便利。骨性關(guān)節(jié)炎的病理特點(diǎn)是關(guān)節(jié)軟骨的退變?yōu)橹?滑膜和軟骨下骨同時(shí)發(fā)生病變。長期以來,廣大學(xué)者認(rèn)為骨性關(guān)節(jié)炎是一種退行性病變。但是隨著近年來對骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制的深入研究,逐漸發(fā)現(xiàn)骨性關(guān)節(jié)炎也是一種炎癥性疾病。許多炎癥因子在疾病的進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用,其中IL-1β已經(jīng)被證實(shí)在骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程中起到關(guān)鍵作用。正常的軟骨細(xì)胞幾乎不分泌IL-1β,但是關(guān)節(jié)軟骨在遭受創(chuàng)傷時(shí),軟骨細(xì)胞分泌IL-1β水平明顯升高。IL-Iβ可以與軟骨細(xì)胞表面的IL-1受體結(jié)合,激活細(xì)胞內(nèi)的一系列信號(hào)通路,從而激活下游的轉(zhuǎn)錄因子,使得金屬蛋白酶的表達(dá)量增加,降解軟骨外基質(zhì),引起關(guān)節(jié)軟骨的病變,并最終引起骨性關(guān)節(jié)炎。研究目的1、應(yīng)用包含beta-lactamase報(bào)告基因的THP-1細(xì)胞進(jìn)行藥物庫篩選,找到一種可以抑制IL-1β激活的NF-κB通路的藥物。2、將該藥物應(yīng)用于軟骨細(xì)胞,驗(yàn)證該藥物是否可以在軟骨細(xì)胞上具有抑制IL-1 β激活的NF-KB通路的作用。3、用該藥物治療骨性關(guān)節(jié)炎模型的小鼠,檢測是否具有預(yù)防小鼠骨性關(guān)節(jié)炎進(jìn)展的作用。4、驗(yàn)證該藥物抑制IL-1 β激活的NF-KB通路的作用機(jī)制。研究方法1、首先我們利用含有beta-lactamase報(bào)告基因的THP-1細(xì)胞進(jìn)行藥物庫篩選,將細(xì)胞分為對照組,藥物治療組、IL-1β組,讀取熒光數(shù)值后分別計(jì)算兩組之間的比率,從而尋找能夠抑制白介素-1 β作用的藥物。2、將第一步初篩后得到的具有預(yù)期作用的藥物升高藥物作用濃度后,繼續(xù)進(jìn)行該試驗(yàn)。然后降低藥物作用濃度后,繼續(xù)進(jìn)行該試驗(yàn)。3、根據(jù)各種藥物的臨床適應(yīng)癥排除那些用于治療惡性腫瘤或者具有較大副作用的藥物后,將剩余的藥物進(jìn)行最后一次篩選,選定一種作用效果最強(qiáng)的藥物進(jìn)行后續(xù)研究。4、將該藥物作用于軟骨細(xì)胞,western blot驗(yàn)證其NF-KB通路上的各個(gè)因子磷酸化是否被抑制。western blot和免疫熒光驗(yàn)證p65向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移是否被抑制,Elisa驗(yàn)證NF-KB與DNA的結(jié)合能力是否被抑制。5、將該藥物作用于軟骨細(xì)胞,qRT-PCR和western blot驗(yàn)證其是否能夠抑制金屬蛋白酶的表達(dá)。應(yīng)用qRT-PCR驗(yàn)證是否可以抑制其他炎癥因子的表達(dá)。同時(shí)驗(yàn)證能否促進(jìn)軟骨外基質(zhì)的合成。6、用該藥物治療骨性關(guān)節(jié)炎模型小鼠,分為藥物治療組和PBS治療組,灌胃治療16周,Safranin 0染色觀察是否會(huì)延緩軟骨丟失。應(yīng)用免疫組化染色,判斷該藥物是否會(huì)延緩軟骨外基質(zhì)的降解,是否會(huì)抑制金屬蛋白酶的表達(dá)。7、對骨性關(guān)節(jié)炎的小鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測,觀察是否會(huì)延緩小鼠行為能力的喪失。進(jìn)行Von Frey痛閾檢測,和疼痛相關(guān)的基因表達(dá)的檢測,觀察該藥物是否會(huì)減輕骨性關(guān)節(jié)炎的癥狀。8、應(yīng)用該藥物處理軟骨細(xì)胞,檢測該藥物是否對IL-1受體1(IL-R1)的表達(dá)有影響。9、應(yīng)用該藥物和自噬現(xiàn)象的抑制劑處理軟骨細(xì)胞,檢測該藥物降解IL-R1是否與自噬現(xiàn)象有關(guān)。應(yīng)用westernblot、免疫熒光和qRT-PCR檢測該藥物是否會(huì)激活自噬現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、用美國FDA批準(zhǔn)的989種藥物(1μmol/ml)和IL-lβ同時(shí)作用THP-1細(xì)胞,將得到OD460/OD530比值的結(jié)果做出點(diǎn)狀圖,顯示有多種藥物都具有抑制IL-1β激活的NF-KB信號(hào)通路。2、將初次篩選得到的54種藥物作用濃度調(diào)整為10 μmol/ml,繼續(xù)進(jìn)行藥物篩選,發(fā)現(xiàn)高濃度情況下,大部分藥物仍然有抑制IL-1 β激活的NF-κB信號(hào)通路的作用。3、將初次篩選得到的54種藥物作用濃度調(diào)整為0.1 μmol/ml,繼續(xù)進(jìn)行藥物篩選,發(fā)現(xiàn)低濃度情況下,大部分藥物的作用效果明顯下降。4、根據(jù)FDA批準(zhǔn)的藥物適應(yīng)癥,排除那些用于治療惡性腫瘤或者具有較大副作用的藥物。按照最適藥物濃度進(jìn)行最后一次藥物篩選,得到一種作用效果最強(qiáng)的藥物,命名為 FADIINS(FDA-Approved Drugs that Inhibit IL-1β-NFκB Signaling),用于后續(xù)研究。5、將該藥物作用于軟骨細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)其可以抑制NF-KB通路上的各個(gè)因子的磷酸化。6、該藥物可以抑制p65向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移,抑制NF-KB與DNA結(jié)合的能力。7、該藥物可以抑制金屬蛋白酶MMP-13和ADAMTS-4的表達(dá),同時(shí)也可以抑制其他炎癥因子的表達(dá)。8、FADIINS藥物可以促進(jìn)Aggrecan和膠原蛋白II的基因表達(dá)的上調(diào)。9、Safarnin 0染色顯示該藥物可以延緩細(xì)胞外基質(zhì)的降解,應(yīng)用OARSI Score評分標(biāo)準(zhǔn),顯示PBS治療組關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重于藥物治療組。檢測關(guān)節(jié)炎模型小鼠的血清中COMP fragment濃度,顯示藥物治療組的血清濃度低于PBS治療組。10、組織切片進(jìn)行免疫組化染色,顯示藥物治療組的Aggrecan neo-epitope、COMP fragment、MMP13、Col X均少于PBS治療組,而Col Ⅱ則多于PBS治療組。人軟骨組織離體培養(yǎng)后,檢測培養(yǎng)基中GAG濃度,顯示經(jīng)藥物治療后,GAG的濃度明顯下降。11、在骨性關(guān)節(jié)炎模型(DMM模型)治療到10周時(shí),開始測試小鼠的5分鐘行走距離,每周一次直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,結(jié)果顯示藥物治療組的行走距離明顯多于PBS治療組。統(tǒng)計(jì)小鼠5分鐘站立的次數(shù),顯示藥物治療組多于PBS治療組12、進(jìn)行Von Frey痛閾測試,顯示藥物治療組小鼠患肢的疼痛耐受力要高于PBS治療組。收集小鼠的背根神經(jīng)節(jié),提取RNA后,反轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測,顯示MCP-1和CCR的基因表達(dá)水平在藥物治療組低于PBS治療組。13、軟骨細(xì)胞被藥物處理后,提取細(xì)胞蛋白,行western blot檢測細(xì)胞膜的IL-1受體1(IL-R1)的水平,顯示用藥物處理后,IL-R1水平有所下降。免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示藥物處理后的細(xì)胞膜表面的IL-R1熒光量少于未治療組。免疫組化結(jié)果也顯示,藥物治療組軟骨細(xì)胞表面的IL-R1少于PBS治療組。14、軟骨細(xì)胞被Rapamycin處理后,提取細(xì)胞蛋白行western blot檢測示IL-R1的水平下降,同時(shí)應(yīng)用Rapamycin和Baflomycin處理后,IL-R1的水平恢復(fù),用FADIINS藥物處理后IL-R1的水平下降,同時(shí)應(yīng)用FADIINS藥物和Baflomycin處理后,IL-R1的水平恢復(fù)。15、軟骨細(xì)胞應(yīng)用FADIINS藥物處理后,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LC3II、游離的ATG12水平高于對照組,ATG5-ATG12水平也高于對照組。PCR結(jié)果顯示自噬現(xiàn)象的MarKer,如LC3、ATG5、ATG12的基因水平均升高。軟骨細(xì)胞被FADIINS藥物處理后,免疫熒光結(jié)果顯示LC3表達(dá)量明顯上升。結(jié)論1、利用含有beta-lactamase報(bào)告基因的THP-1細(xì)胞進(jìn)行藥物庫篩選,得到一種能夠抑制IL-1β作用的藥物。2、該藥物可以在軟骨細(xì)胞上抑制IL-1 β激活的NF-KB通路,可以抑制MAPK和NF-KB通路上的蛋白磷酸化。該藥物可以抑制p65向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移,也可以抑制NF-KB與DNA的結(jié)合。3、該藥物可以在軟骨細(xì)胞抑制金屬蛋白酶MMP-13和ADAMTS-4的合成,同時(shí)抑制一些炎癥因子的合成。4、該藥物在一定程度上具有促進(jìn)軟骨外基質(zhì)修復(fù)的作用。5、應(yīng)用該藥物治療骨性關(guān)節(jié)炎模型小鼠后,可以有效地緩解軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解。并且也抑制金屬蛋白酶的合成。6、該藥物可以改善骨性關(guān)節(jié)炎的癥狀,延長步行距離,增加站立次數(shù),同時(shí)減輕患肢疼痛。7、該藥物可以激活自噬現(xiàn)象,并且在軟骨細(xì)胞上可以通過自噬現(xiàn)象,降解IL-R1。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R684.3
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
主要英文縮略詞表
第一部分: 藥物庫篩選得到抑制IL-1 β激活的信號(hào)通路的藥物
    前言
    實(shí)驗(yàn)材料及方法
    實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    討論
    結(jié)論
    參考文獻(xiàn)
第二部分: FADIINS抑制IL-1β激活的信號(hào)通路且抑制軟骨細(xì)胞的分解代謝
    前言
    實(shí)驗(yàn)材料及方法
    實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    討論
    結(jié)論
    參考文獻(xiàn)
第三部分: FADIINS藥物可以抑制小鼠骨性關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展
    前言
    實(shí)驗(yàn)材料及方法
    實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    討論
    結(jié)論
    參考文獻(xiàn)
第四部分: FADIINS通過自噬降解IL-R1
    前言
    實(shí)驗(yàn)材料及方法
    實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    討論
    結(jié)論
    參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及參編書目
學(xué)位論文評閱及答辯情況表
英文文章一
英文文章二

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本文編號(hào)：2894289