脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是脊椎疾病中最常見的致殘致死性損傷,嚴重影響了患者及其家庭的生活質(zhì)量,且隨經(jīng)濟水平的飛速發(fā)展,發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。目前,臨床上SCI的治療手段非常有限,主要通過手術(shù)以解除脊髓壓迫,并用糖皮質(zhì)激素進行沖擊治療以抑制SCI后的炎癥反應(yīng),但糖皮質(zhì)激素治療窗較窄,治療效果有限,且毒副作用嚴重,其臨床應(yīng)用存在很大爭議。近年來,隨著人們對SCI認識的逐漸深入,細胞移植、組織工程等新型治療方式不斷取得新進展。細胞移植可替換丟失的神經(jīng)組織,組織工程可作為橋梁以修復(fù)脊髓缺損,促進脊髓再生,但這兩種方式均易造成脊髓二次損傷,且對SCI后的繼發(fā)性損傷基本無抑制作用,可能對神經(jīng)恢復(fù)和運動學(xué)功能改善情況有限。能夠同時抑制繼發(fā)性損傷并促進神經(jīng)再生或修復(fù)的多靶點治療方式可能是SCI治療的有效策略。鹽酸米諾環(huán)素(minocycline hydrochloride,MC.HC1)是一種廣譜的四環(huán)素類抗生素,具有抗炎、抗氧化和抗凋亡活性,能夠抑制繼發(fā)性損傷并發(fā)揮神經(jīng)保護作用,可顯著改善SCI模型動物的行為學(xué)功能,Ⅱ期臨床試驗結(jié)果也初步表明MC.HC1在SCI患者中有改善運動功能的療效。但因其給藥劑量較大,并需長時間給藥,易導(dǎo)致肝腎毒性。新型納米給藥系統(tǒng)是改善藥物體內(nèi)分布,降低藥物毒副作用的有效手段,且可通過載體材料的功能化實現(xiàn)SCI的多靶點治療。本研究以米諾環(huán)素為模型藥物,分別以能促進神經(jīng)再生及修復(fù)的多聚唾液酸和具有神經(jīng)保護作用的聚乙二醇為親水性聚合物,構(gòu)建納米靶向給藥系統(tǒng),實現(xiàn)藥物的靶向遞送和SCI的多靶點治療。多聚唾液酸(polysialic acid,PSA)是一種位于細胞表面的內(nèi)源性碳水化合物,在細胞遷移、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、突觸形成、神經(jīng)系統(tǒng)受損后的修復(fù)和神經(jīng)再生中起重要作用,且有利于軸突的長距離生長,本研究以PSA為親水性聚合物,利用PSA上游離羧基與硬脂胺(octadecylamine,ODA)上氨基間的酰胺反應(yīng),對PSA進行疏水性修飾,得到多聚唾液酸-硬脂胺嫁接物(PSA-ODA,PSO),用于負載米諾環(huán)素,并通過控制ODA的投料比,得到不同ODA取代度的PSO。嫁接物能夠在水性介質(zhì)中自組裝形成膠束,當ODA投料比從5%增加至20%時,嫁接物臨界膠束濃度(critical micelle concentration,CMC)從 126.1 降低至 37.3μg/mL,膠束粒徑從149.00±7.21減小至84.40±8.42nm;ODA投料比為10%和20%得到的PSO嫁接物均能有效負載米諾環(huán)素(minocycline,MC),包封率均在70%以上,載藥量可達12%,體外釋放結(jié)果顯示負載MC的PSO嫁接物載藥膠束(PSM)藥物釋放可持續(xù)至72 h,但ODA投料比為20%得到的PSM膠束藥物釋放較慢,不利于SCI的治療,因此選用ODA投料比為10%得到的PSO嫁接物進行后續(xù)實驗。以BV2細胞和原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細胞為模型,考察PSO嫁接物的細胞毒性和細胞內(nèi)在化能力,結(jié)果表明細胞與1-1000 μg/mLPSO共孵育48h后,細胞存活率均在90%以上,表明嫁接物具有低細胞毒性,且PSO嫁接物能較快地被兩種細胞攝取,攝取呈時間依賴性;采用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激BV2細胞和原代小膠質(zhì)細胞,構(gòu)建炎癥細胞模型,以MC.HC1為陽性對照,考察PSM的抗炎作用,結(jié)果表明炎癥細胞與PSM共孵育后,TNF-α,IL-6和NO的釋放量明顯降低,iNOS和Iba-1的表達也明顯下調(diào),且與MC.HC1組相比,無明顯差異;以SH-SY5Y細胞為模型細胞,采用H2O2刺激構(gòu)建體外神經(jīng)細胞受損模型,考察PSM的神經(jīng)保護作用,結(jié)果表明H2O2刺激SH-SY5Y細胞經(jīng)PSM預(yù)處理后,細胞內(nèi)鈣離子濃度降低,細胞存活率和活細胞數(shù)目明顯增加,凋亡和壞死比例降低,且PSM神經(jīng)保護作用與MC.HCl相當,PSO嫁接物膠束基本無抗炎和神經(jīng)保護作用。以雌性SD大鼠為模型動物,采用重物墜落法建立SCI模型,PSO嫁接物膠束經(jīng)靜脈給藥后可有效分布至脊髓受損部位,且在脊髓組織白質(zhì)和灰質(zhì)中均勻分布。MC.HC1和PSM經(jīng)尾靜脈注射給藥24h后,與Saline組相比,脊髓受損部位TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA和NO的濃度顯著降低,SOD酶的活力明顯增強,iNOS蛋白表達有顯著下降,細胞凋亡明顯減少,繼發(fā)性損傷得到有效抑制,PSM組與MC.HC1組相比,無明顯差異。MC.HCl、PSM和PSO連續(xù)給藥7d后,采用Basso-Beattle-Bresnahan(BBB)評分法考察大鼠后肢的運動學(xué)功能,結(jié)果表明在術(shù)后12w的觀察周期內(nèi),與Saline組相比,MC.HCl、PSM和PSO組大鼠后肢的運動學(xué)功能明顯改善,其中PSM改善效果明顯優(yōu)于MC.HC1和PSO組;術(shù)后12w,采用核磁共振儀、皮質(zhì)脊髓束順行示蹤技術(shù)和免疫熒光等方法考察不同治療方法對脊髓組織的改善作用和不同組脊髓組織的病理學(xué)變化,結(jié)果表明MC.HC1、PSM和PSO能顯著減小脊髓受損部位的空洞面積,增加BDA陽性染色神經(jīng)纖維數(shù)目,明顯改善損傷所致的脫髓鞘病變、顯著減少膠質(zhì)瘢痕的形成和軸突的壞死;與MC.HCl和PSO組相比,PSM組呈現(xiàn)更好的治療效果,軸突能長距離生長并與尾側(cè)組織重新建立連接。此外,術(shù)后4 w,在PSM組脊髓受損部位可明顯觀察到神經(jīng)元的再生,可能原因為藥物可通過抑制繼發(fā)性損傷,為神經(jīng)再生提供合適的微環(huán)境,而PSA能促進神經(jīng)干細胞和神經(jīng)前體細胞的分裂和增殖,從而使再生神經(jīng)元數(shù)目明顯增加。MC.HC1連續(xù)給藥7d后,血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、血肌酐和尿素氮的濃度顯著升高,對肝腎均有一定毒性,PSO和PSM組生化指標與正常組接近,結(jié)果表明PSO嫁接物及構(gòu)建的載藥膠束安全性較高。聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)作為膜封閉劑,可通過修復(fù)受損的細胞膜、細胞器膜和軸突膜減少鈣離子內(nèi)流,維持細胞正常功能并修復(fù)變性軸突,減少由繼發(fā)性損傷導(dǎo)致的細胞壞死和凋亡,發(fā)揮神經(jīng)保護作用。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上,以兩端羧基化的PEG為親水性聚合物,利用PEG上羧基與聚-(乳酸-羥基乙酸)(poly-(lactic-co-glycolic acid),PLGA)和唾液酸(sialic acid,SA)上羥基間的酯化反應(yīng)對PEG進行疏水性和靶向修飾,合成得到SA修飾的PEG-PLGA(PP)共聚物(SAPP);PP和SAPP共聚物的CMC分別為14.40 ± 2.32和18.78 ± 3.28μg/mL,且PP和SAPP膠束均能有效負載MC,包封率在65%以上;體外釋放結(jié)果顯示,載藥膠束(PPM和SAPPM)呈現(xiàn)明顯的緩釋特征,體外釋放時間超過72 h,累積釋放百分率可達85%左右;SA修飾對空白共聚物膠束和載藥膠束的粒徑、電位、膠束形態(tài)、載藥量、包封率和藥物釋放基本無影響。以BV2細胞為模型,考察PP和SAPP的細胞毒性和細胞內(nèi)在化能力,結(jié)果表明PP和SAPP細胞毒性低,且均能被BV2細胞較快攝取,攝取呈時間依賴性;PPM、SAPPM和MC.HCl在LPS刺激的BV2細胞上抗炎效果相當,而PP和SAPP基本無抗炎活性;以SH-SY5Y為模型細胞,采用谷氨酸(glutamate,Glu)構(gòu)建體外興奮性中毒神經(jīng)細胞模型,考察PEG和MC.HCl的神經(jīng)保護作用,結(jié)果表明Glu刺激SH-SY5Y細胞經(jīng)MC.HCl、PPM、SAPPM、PP和SAPP預(yù)處理后,細胞內(nèi)鈣離子濃度降低,細胞存活率增加,凋亡比例降低,且由于PEG和MC的協(xié)同作用,使得PPM和SAPPM對神經(jīng)細胞的保護作用優(yōu)于其他組,PPM和SAPPM組間無顯著性差異。以HUVEC為模型細胞,采用LPS刺激模擬SCI后損傷部位的炎癥血管內(nèi)皮細胞,考察細胞對SAPP的攝取。結(jié)果表明細胞經(jīng)LPS刺激后,E-選擇素受體表達明顯上調(diào),SAPP可通過與E-選擇素受體的特異性結(jié)合靶向性地被LPS刺激的HUVEC細胞攝取,且E-選擇素受體被游離SA部分阻斷后,細胞對SAPP的攝取減弱。以SCI大鼠為模型,考察SAPP在模型動物體內(nèi)各組織臟器的分布和在脊髓組織中的經(jīng)時分布,結(jié)果表明SCI模型動物損傷部位E-選擇素受體的表達明顯增加,SAPP可通過與E-選擇素受體的特異性結(jié)合,實現(xiàn)脊髓受損部位的靶向分布,經(jīng)尾靜脈注射12 h后分布最多,且單位質(zhì)量脊髓組織內(nèi)的熒光強度高于肝臟,具有良好的靶向性。以SCI大鼠為模型動物,MC.HC1、PPM和SAPPM經(jīng)尾靜脈注射給藥24 h后,脊髓受損部位TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA和NO的濃度顯著降低,SOD酶活力明顯增強,iNOS和caspase-3蛋白表達顯著降低,繼發(fā)性損傷得到有效抑制,其中,SAPPM對繼發(fā)性損傷的抑制作用明顯優(yōu)于PPM組,與MC.HCl組相比,則無顯著差異。MC.HC1、PPM、SAPPM、PP和SAPP連續(xù)給藥7d后,在術(shù)后12w的觀察周期內(nèi),大鼠后肢的運動學(xué)功能明顯改善。術(shù)后12 w,采用核磁共振儀、免疫熒光等方法考察不同組大學(xué)脊髓組織的病理學(xué)變化,結(jié)果表明不同治療方法均能顯著減小脊髓受損部位的空洞面積,改善損傷所致的脫髓鞘病變和減少軸突的壞死,SAPPM組改善效果最明顯;術(shù)后12 w,MC.HC1和PPM組大鼠肝腎組織可見明顯病變,表明MC.HCl和PPM對肝腎均有一定毒性,PP、SAPP和SAPPM組大鼠各組織臟器均無可見病變,結(jié)果表明PP、SAPP和SAPPM安全性較高。本研究構(gòu)建的兩種功能性米諾環(huán)素遞藥系統(tǒng)均能通過藥物向脊髓受損部位的靶向遞送,實現(xiàn)繼發(fā)性損傷的有效抑制,同時,殘留的PSA可促進神經(jīng)的再生及修復(fù),PEG可發(fā)揮神經(jīng)保護作用,通過藥物和載體的協(xié)同作用,實現(xiàn)SCI的安全高效治療,為SCI治療方法提供新策略和新思路。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R651.2
【部分圖文】：

１．３．２．１空白嫁接物膠束及負載米諾環(huán)素的嫁接物載藥膠束的粒徑分布和形態(tài)觀察??當ＯＤＡ投料比為１０％得到的ＰＳＯ嫁接物的濃度為１?ｍｇ／ｍＬ時，空白膠束??（ＰＳＯ）和載藥膠束（ＰＳＭ）的粒徑分布和形態(tài)如圖１．４所示。結(jié)果表明：與空白??膠束相比，載藥后粒徑減小，可能是因為藥物與疏水內(nèi)核間的相互作用使膠束的疏??水內(nèi)核結(jié)合更加緊密；ＴＥＭ圖片顯示的空白和載藥膠束的粒徑均略小于動態(tài)光散??射法測到的水合粒徑，可能原因為在制備透射電鏡樣品過程中，親水性外殼發(fā)生皺??縮；ＰＳＯ和ＰＳＭ膠束的微粒形態(tài)呈規(guī)則的球形，且粒徑均一。??１４??

為研究ＯＤＡ取代度對ＰＳＭ膠束藥物釋放的影響，本研究以ｐＨ?７．４?ＰＢＳ為釋??放介質(zhì)，采用透析袋法對不同ＯＤＡ取代度ＰＳＭ膠束的體外釋放行為進行表征（米??諾環(huán)素投藥量為２０％）。結(jié)果如圖１．５所示，結(jié)果表明：與游離ＭＣ．ＨＣ１相比，ＰＳＭ??的藥物釋放呈現(xiàn)明顯的雙相釋放特征，前１２?ｈ釋放相對較快，此后藥物釋放相對??緩慢，藥物釋放時間可延長至７２?ｈ。當固定米諾環(huán)素投藥量為２０％時，隨ＯＤＡ投??料比的增加，嫁接物中ＯＤＡ取代度增加，藥物釋放速率明顯減慢，到７２?ｈ時，??ＰＳＯ（１０％）／ＭＣ和ＰＳＯ（２０％）／ＭＣ載藥膠束的累積藥物釋放百分率分別為６１．５７?土??２．３７％和８５．４５?±?０．７８％，可能原因為隨ＯＤＡ取代度的增加，疏水內(nèi)核與米諾環(huán)??素間的相互作用力增強，從而使藥物釋放速率明顯減慢，而米諾環(huán)素用于治療ＳＣＩ??的主要機制為抑制急性原發(fā)性損傷后的繼發(fā)性損傷，發(fā)揮其抗炎，抗氧化和神經(jīng)保??護作用，較慢的藥物釋放速率不利于ＳＣＩ的治療�；诖�，我們選用ＯＤＡ投料比??為１０％得到的ＰＳＯ嫁接物進行后續(xù)研究。??１００－１??？?４０＼ｕｒ＾?—?ｍｃ．ｈｃｉ??＾?ｍ?一?ＰＳＯ（２０％）／ＭＣ??Ｉ?２０?Ｊ?一?ＰＳＯ（１０％）／ＭＣ??５?ｏｊ——

生成量和活細胞數(shù)目及細胞的活性呈正相關(guān)。甲瓚能夠溶于二甲亞砜，并在５７０ｎｍ??處有紫外吸收，可采用酶標儀測定細胞經(jīng)不同處理后在此波長下的吸光度值，從而??間接反映細胞的活性及增殖情況。結(jié)果如圖２．１所示，當ＢＶ２細胞和原代小膠質(zhì)??細胞與１？１００〇Ｈｇ／ｍＬ的嫁接物共孵育４８ｈ后，細胞的存活率均在９０％以上，說明??ＰＳＯ嫁接物具有低細胞毒性。??１２〇＞｜?ＥＳＳＳ３?ＢＶ２??ＣＳＳ?Ｐｒｉｍａｒｙ?ｍｉｃｒｏｇｌｉａ??ｉｌｌ??０?２?５?１０?２０?５０?１００?２００?５００?１０００??Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?（ｍｇ／ｍＬ）??圖２．１?ＢＶ２細胞和原代小膠質(zhì)細胞與不同濃度的ＰＳＯ嫁接物共孵育４８?ｈ后的細胞??存活率??Ｆｉｇｒｕｅ?２．１?Ｃｅｌｌ?ｖｉａｂｉｌｉｔｉｅｓ?ｏｆ?ＢＶ２?ａｎｄ?ｐｒｉｍａｒｙ?ｍｉｃｒｏｇｌｉａ?ａｆｔｅｒ?ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ?ｗｉｔｈ?ＰＳＯ?ａｔ??ｖａｒｉｏｕｓ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ?ｆｏｒ?４８?ｈ．?Ｄａｔａ?ｗｅｒｅ?ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ?ａｓ?ｍｅａｎ?土?ＳＤ?（ｎ?＝?５）??２．３．２多聚唾液酸－硬脂胺嫁接物膠束的細胞攝取??小膠質(zhì)細胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的免疫細胞，廣泛存在于大腦和脊髓中。脊髄??損傷后，小膠質(zhì)細胞大量激活，廣泛介導(dǎo)局部的炎癥反應(yīng)，并釋放ＴＮＦ－ａ，１Ｌ－６等??細胞毒性物質(zhì)，使損傷范圍進一步擴大｜（＞５］。米諾環(huán)素用于治療ＳＣＩ其中較重要的??作用機制為抑制小膠質(zhì)細胞的激活，而作為藥物遞送系統(tǒng)，ＰＳＯ嫁接物能否將藥??物遞送至靶細胞內(nèi)是評價此遞送系統(tǒng)優(yōu)劣的重要指標，因此本研究以原代小膠質(zhì)??細胞和ＢＶ２細胞為模型細胞

本文編號：2893880