[研究目的]高位頸髓損傷患者,呼吸功能喪失,死亡率極高,為了降低此類患者的死亡率,重建其自主呼吸功能尤為重要。本課題組在國家自然基金的資助下,采用副神經(jīng)移位膈神經(jīng)的方法成功重建了高位頸髓損傷大鼠的呼吸功能,建立了動物模型。本研究旨在通過腺相關(guān)病毒、偽狂犬病毒逆行示蹤及免疫組織化學(xué)染色的方法進(jìn)一步揭示副神經(jīng)移位膈神經(jīng)重建高位頸髓損傷大鼠呼吸功能的中樞機(jī)制,為進(jìn)一步將該方法學(xué)運(yùn)用于臨床提供更為殷實(shí)的理論依據(jù)。[研究方法]本實(shí)驗(yàn)以成年雄性SD大鼠為實(shí)驗(yàn)動物。利用腺相關(guān)病毒AAV-RetroGFP注射副神經(jīng)、膈神經(jīng),進(jìn)行跨單突觸逆行追蹤支配正常SD大鼠副神經(jīng)和膈神經(jīng)的運(yùn)動神經(jīng)元。利用偽狂犬病毒PRV-CMV-EGFP注射副神經(jīng)、膈神經(jīng),進(jìn)行跨多級突觸逆行追蹤支配正常SD大鼠副神經(jīng)和膈神經(jīng)的前運(yùn)動神經(jīng)元及其相關(guān)神經(jīng)核團(tuán)。利用免疫組織化學(xué)染色的方法,對病毒標(biāo)記核團(tuán)進(jìn)行特異性雙標(biāo),進(jìn)一步確證病毒標(biāo)記的神經(jīng)核團(tuán)。相同方法,利用腺相關(guān)病毒AAV-Retro-GFP、偽狂犬病毒PRV-CMVEGFP注射吻合神經(jīng)吻合處遠(yuǎn)端,進(jìn)行逆行追蹤副神經(jīng)移位膈神經(jīng)6個(gè)月后支配SD大鼠膈肌運(yùn)動的運(yùn)動神經(jīng)元、前運(yùn)動神經(jīng)元及其相關(guān)神經(jīng)核團(tuán)。并利用特異性抗體對病毒標(biāo)記核團(tuán)進(jìn)行雙標(biāo),進(jìn)一步確證病毒標(biāo)記神經(jīng)核團(tuán)。最后,通過對比支配正常SD大鼠的膈神經(jīng)、副神經(jīng)及神經(jīng)移位后SD大鼠的吻合神經(jīng)的運(yùn)動神經(jīng)元、前運(yùn)動神經(jīng)元及其相關(guān)神經(jīng)核團(tuán)的變化,初步揭示神經(jīng)移位重建高位頸髓損傷SD大鼠呼吸功能的中樞機(jī)制變化。[結(jié)果](1)正常SD大鼠:支配副神經(jīng)斜方肌支的運(yùn)動神經(jīng)元主要集中在延髓網(wǎng)狀核。支配副神經(jīng)的前運(yùn)動神經(jīng)元主要集中在孤束核、延髓中縫、面神經(jīng)核。支配膈神經(jīng)的運(yùn)動神經(jīng)元主要集中在頸髓C4-C6的脊髓前角。支配膈神經(jīng)的前運(yùn)動神經(jīng)元主要集中在腹側(cè)呼吸群、延髓孤束核、延髓中縫、上橄欖核。(2)神經(jīng)移位后SD大鼠:支配吻合神經(jīng)的運(yùn)動神經(jīng)元主要集中在延髓網(wǎng)狀核。支配吻合神經(jīng)的前運(yùn)動神經(jīng)元主要集中在孤束核、延髓中縫、面神經(jīng)核。[結(jié)論]神經(jīng)移位6個(gè)月后,SD大鼠的副神經(jīng)核和(或)上級神經(jīng)元發(fā)生了重塑,形成了與腹側(cè)呼吸群神經(jīng)元相同或相似的突觸,從而建立了副神經(jīng)核→副神經(jīng)→膈神經(jīng)→膈肌的神經(jīng)支配通路。最終由副神經(jīng)核神經(jīng)元產(chǎn)生節(jié)律性電沖動,通過吻合后神經(jīng)支配膈肌,重建高位頸髓損傷后大鼠的呼吸功能。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R651.2
【部分圖文】：

神經(jīng)移位膈神經(jīng)動物模型的制備，選取成年健康雄性 SD 大鼠 46 只，體重 280~300g。0 只，B 組 36 只。A 組為右側(cè)副神經(jīng)斜方肌支吻合膈神B 組不做處理。A 組按上述神經(jīng)移位方法學(xué)進(jìn)行手術(shù)處法，手術(shù)主要過程如圖-1（因血液影響圖片質(zhì)量，故圖片 圖：正常 SD 大鼠副神經(jīng)解剖。1 標(biāo)示副神經(jīng)主干，起乳突肌支，于胸鎖乳突肌內(nèi)側(cè)穿入支配胸鎖乳突肌；3 乳突�。▓D中 4 標(biāo)示）內(nèi)側(cè)向背側(cè)前行，穿入斜方肌，支頸部膈神經(jīng)起始部解剖。5 標(biāo)示膈神經(jīng)主干，由臂叢神經(jīng)側(cè)膈��；6 標(biāo)示臂叢神經(jīng)主干及其分支。c 圖：正常 SD解剖。d 圖：副神經(jīng)斜方肌支與膈神經(jīng)端-端吻合后解剖神經(jīng)主干端-端吻合后神經(jīng)。D 大鼠完全清醒后，送至同濟(jì)大學(xué)動物飼養(yǎng)房，予以充足A、B 兩組 SD 大鼠均無死亡。

（一） 正常 SD 大鼠副神經(jīng)中樞神經(jīng)通路的研究1、AAV 逆行示蹤正常 SD 大鼠副神經(jīng)運(yùn)動神經(jīng)元為了研究副神經(jīng)第一級運(yùn)動神經(jīng)元所處位置，我們利用逆行跨單突觸的 AAV 病毒，逆行示蹤副神經(jīng)運(yùn)動神經(jīng)元。腺相關(guān)病毒 AAV 是良好的跨單突觸逆行示蹤病毒它具有穩(wěn)定性、低毒性、基因持久表達(dá)性等特性，這些特性使它成為了跨單突觸逆行示蹤神經(jīng)元最好的工具病毒之一[25]。取 B 組正常 SD 大鼠 4 只，隨機(jī)分為甲、乙兩組每組兩只，甲組為副神經(jīng)胸鎖乳突肌支組，乙組為副神經(jīng)斜方肌支組。在手術(shù)顯微鏡下，通過顯微注射器將 AAV-Retro-GFP 病毒（2.00E+09 PFU/ml；1.5uL/只）分別注入甲、乙兩組 SD 大鼠右側(cè)副神經(jīng)胸鎖乳突肌支及副神經(jīng)斜方肌支，注射方法詳見上述實(shí)驗(yàn)方法，注射主要過程如圖-2 所示（因病毒無色，故注射前，我們往病毒內(nèi)加入微量無菌染料，利于注射）�？梢姴《咀⑸溥M(jìn)入神經(jīng)外膜內(nèi)，未出現(xiàn)病毒明顯外溢現(xiàn)象。待 SD 大鼠完全蘇醒后，將其轉(zhuǎn)移入 SPF 級動物房，給予充足食物、飲水。

圖-3 SD 大鼠灌流取腦：a 圖表示心臟灌流；b 圖表示暴露腦組織及頸髓；c 圖表示腦組織及頸髓。取出后的腦組織及頸髓進(jìn)行PFA固定、蔗糖脫水、OTC包埋、冰凍切片等處理，處理方法見前述實(shí)驗(yàn)方法。待得到腦組織及頸髓冰凍切片后，對冰凍切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色處理，免疫組織化學(xué)染色方法見前述實(shí)驗(yàn)方法，免疫組織化學(xué)染色過程中所使用的抗體：I抗—goat anti-GFP （1:2000；NOVUS）；II抗—488 donkey anti-goatlgG（1：500；life technologies）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：AAV-Retro-GFP病毒注射副神經(jīng)胸鎖乳突肌支14天后，AAV-Retro-GFP病毒逆行感染副神經(jīng)胸鎖乳突肌支第一級運(yùn)動神經(jīng)元，其冰凍切片顯示腦組織中未見病毒示蹤，而在頸髓C3到C6脊髓前角中可見AAV病毒示蹤，顯現(xiàn)綠色熒光，故支配副神經(jīng)胸鎖乳突肌支第一級運(yùn)動神經(jīng)元主要位于頸3-頸6脊髓前角，如圖-4所示。AAV-Retro- GFP病毒注射副神經(jīng)斜方肌支14天后，AAV-Retro-GFP病毒逆行感染副神經(jīng)斜方肌支第一級運(yùn)動神經(jīng)元，其冰凍切片顯示腦組織的延髓網(wǎng)狀核中見病毒示蹤，顯現(xiàn)綠色熒光，而在頸髓C1到C7脊髓前角中未見AAV病毒示蹤，故支配副神經(jīng)斜方肌支第一級運(yùn)動神經(jīng)元位于主要延髓網(wǎng)狀核，如圖-5所
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2892346