研究背景隨著人口數量增長,人口老齡化程度加劇及致癌因素的普遍性,癌癥發(fā)病率和病死率呈上升趨勢。目前,我國癌癥的發(fā)病率略次于美國位列全球第二,癌癥病死率位于各國之首,發(fā)病率和病死率遠遠高于世界平均水平。癌痛是中晚期癌癥患者不可避免的問題。骨癌痛(BCP)是最常見的癌痛類型,常由原發(fā)性骨腫瘤或腫瘤繼發(fā)骨轉移引起。原發(fā)骨腫瘤及約三分之一腫瘤骨轉移的患者都會出現(xiàn)不同程度的骨痛,約三分之二的晚期癌癥都傾向于骨轉移,常轉移至后腰部、骨盆、長骨及肋骨。盡管骨骼不是重要器官,很多常見的腫瘤都容易發(fā)生骨轉移。腫瘤的骨轉移被認為是BCP形成的最常見原因,腫瘤轉移至骨骼及侵犯周圍組織,可導致疼痛,后者及伴隨的高鈣血癥、易感染、病理性骨折及脊柱穩(wěn)定性差,不僅影響患者的生活質量,亦可導致患者的抑郁和焦慮,給家庭和社會造成沉重負擔�，F(xiàn)有的鎮(zhèn)痛藥物或療法,包括阿片類藥物,非甾體類抗炎藥物、雙膦酸鹽類藥物及放療,常無法達到足夠的鎮(zhèn)痛效果或伴有嚴重不良反應。因此,明確BCP形成和維持機制及發(fā)現(xiàn)有效的治療方法對于改善患者的生活質量,減輕家庭和社會負擔具有一定意義。內皮素-1(ET-1)是由二十一個氨基酸組成的多肽鏈,是人體內含量最多的三種內皮素之一。作為神經調質,其廣泛表達于中樞神經系統(tǒng),參與多種疼痛調節(jié)。其調節(jié)疼痛主要是通過活化內皮素A受體(ETAR)和內皮素B受體(ETBR)實現(xiàn)的,兩者皆為其特異性G蛋白偶聯(lián)受體。ET-1在疼痛調節(jié)中發(fā)揮重要作用,鞘內注射ET-1可減輕疼痛模型動物的疼痛。相同地,在炎性痛和神經病理性痛模型中,星形膠質細胞過表達ET-1小鼠表現(xiàn)出疼痛減輕,而神經元特異性ET-1敲除小鼠則顯示出了相反的結果。在神經病理性痛中,ET-1、ETAR和ETBR表達上調,共同參與疼痛的調節(jié)。BCP具有神經病理性痛特征,而ET-1、ETAR和ETBR在BCP中的表達變化,尚不清楚。蛋白激酶B(Akt)是介導多種細胞增殖、存活和分化的信號傳導通路,廣泛表達于脊髓背角Ⅰ-Ⅳ層,調節(jié)傷害性刺激。其參與炎性痛和神經病理性痛引發(fā)的中樞敏化。除Akt外,細胞外調節(jié)激酶(ERK)信號通路在突觸和神經元可塑性的調節(jié)中也發(fā)揮重要作用,它同樣調節(jié)傷害性刺激誘發(fā)的外周和中樞敏化。脊髓Akt和ERK通路存在交叉和聯(lián)系,共同參與神經病理性痛時機體的病理生理學和神經化學變化。在神經病理性痛中脊髓Akt和ERK表達上調,共同促進疼痛的發(fā)展。BCP具有神經病理性痛特征,而脊髓Akt和ERK通路在BCP中的作用,尚不清楚。盡管ET-1調節(jié)疼痛通過活化ETAR和ETBR實現(xiàn),但主要是通過ETAR介導的。如當ET-1施加于暴露的坐骨神經外時,大鼠產生患側后爪退縮,這種作用可被提前腹腔注射嗎啡阻斷或完全預防,注射ETAR拮抗劑可逆轉,但ETBR拮抗劑無效。在熱痛模型中,中樞給予ET-1的鎮(zhèn)痛作用可被ETAR拮抗劑阻斷,而ETBR拮抗劑無效,表明ET-1在中樞神經系統(tǒng)的鎮(zhèn)痛作用通過ETAR,而非ETBR介導。在脊髓損傷模型中,鞘內注射ETAR拮抗劑BQ-123可減輕神經病理性痛,而ETBR拮抗劑BQ-788無效,此結果表明,ET-1調節(jié)疼痛通過ETAR,并不通過ETBR。脊髓Akt和ERK表達上調參與神經病理性痛的而形成和維持,而抑制Akt和ERK或其上游蛋白的表達可減輕疼痛。鞘內注射ETAR受體拮抗劑BQ-123可下調神經病理性痛小鼠脊髓Akt和ERK表達而減輕疼痛。由于BCP具有神經病理性痛特征,鞘內注射ETAR拮抗劑對小鼠BCP的影響及機制,尚不清楚。本研究一方面旨在明確脊髓ET-1及其受體在BCP中變化,同時評價脊髓Akt和ERK通路在BCP成形和維持中的作用,為明確BCP機制,發(fā)現(xiàn)可能的治療靶點提供依據;另一方面,通過評價鞘內注射ETAR拮抗劑對小鼠BCP的影響,明確了其減輕BCP的可能分子機制,可為臨床BCP治療方法的研究提供新方向。本研究分為兩部分,第一部分:脊髓ET-1及其受體、Akt和ERK通路在BCP中的變化;第二部分:鞘內注射ETAR拮抗劑通過抑制脊髓Akt和ERK通路減輕對小鼠BCP。研究目的第一部分:小鼠BCP模型制備成功后,通過檢測痛行為學、組織學、脊髓ET-1、ETAR和ETBR基因表達及蛋白表達,Akt和ERK通路蛋白表達,明確ET-1及其受體在BCP中的變化及脊髓Akt和ERK通路在BCP形成和維持中的作用。第二部分:鞘內注射ETAR拮抗劑BQ-123后,通過檢測小鼠痛行為學及脊髓Akt和ERK通路蛋白表達,明確鞘內注射BQ-123對小鼠BCP的影響及可能機制。研究方法第一部分:NCTC 2472腫瘤細胞系培養(yǎng)于含10%馬血清NCTC 135培養(yǎng)基,培養(yǎng)箱參數設置為37℃,5%CO2和95%02,細胞每周傳代兩次。雄性C3H/HeJ小鼠,4～6周齡,體質量20～25 g,采用股骨骨髓腔接種NCTC 2472腫瘤細胞的方法制備BCP模型。將小鼠隨機分為兩組:假手術組(Sham組)和骨癌痛組(BCP組)。每組隨機選擇8只小鼠固定行痛行為學檢測,包括自發(fā)抬足次數(NSF)和機械縮足反應閾(PWT)。采用盲法,痛行為學檢測人員對小鼠的處理方式不知情。于腫瘤細胞接種后-1、7、14和21 d分別檢測NSF和PWT,隨后每組隨機處死5只小鼠,取脊髓L4-6節(jié)段,采用實時定量PCR法檢測ET-1mRNA、ETAR mRNA 和 ETBR mRNA 表達水平。采用 Western blot 法檢測 ET-1、ETAR和ETBR蛋白表達,同時檢測磷酸化Akt(p-Akt)、總Akt(t-Akt)、磷酸化ERK-1/2(p-ERK-1/2)和總 ERK-1/2(t-ERK-1/2)表達,并計算 p-Akt/t-Akt 和p-ERK-1/2/t-ERK-1/2。于腫瘤細胞接種后21d,各組分別取患側股骨行組織學檢測。第二部分:將小鼠隨機分為7組:Sham+NS組、Sham+BQ-123組、Sham+BQ-788組、BCP組、BCP+NS、BCP+BQ-123和BCP+BQ-788組。每組隨機選擇8只小鼠固定行NSF檢測,另選擇8只小鼠固定行PWT檢測。選擇L5-6椎間孔穿刺行鞘內注射給藥。于腫瘤細胞接種后14d(痛行為學檢測后)行鞘內注射,Sham+BQ-123組和 BCP+BQ-123組小鼠分別鞘內注射BQ-123(30 nmol in7 μl per dose),Sham+BQ-788組和BCP+BQ-788組小鼠分別鞘內注射BQ-788(10 nmol in 7μlper dose),Sham+NS組和BCP+NS組注入等量生理鹽水,注射速度為1 μl/s。痛行為學檢測于鞘內注射前即刻及注射后每30 min檢測一次,至注射后180 min。采用盲法,痛行為學檢測人員對小鼠的處理方式不知情。痛行為學檢測中,于BCP+BQ-123組痛行為學改善最明顯的時點,每組隨機選擇5只小鼠,處死后取脊髓L4-6節(jié)段,采用Western boot法檢測p-Akt、t-Akt、p-ERK-1/2及t-ERK-1/2的表達水平,并計算p-Akt/t-Akt和p-ERK-1/2/t-ERK-1/2。結果第一部分:與-1d時比較,Sham組于腫瘤細胞接種后4、7、10、14和21 d時NSF和PWT變化差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),BCP組于腫瘤細胞接種后7、10、14 和 21d 時 NSF 升高,PWT 降低(P0.01 或 0.001);與 Sham 組比較,BCP 組小鼠 7、10、14 和 21 d 時 NSF 升高,PWT 降低(P0.01 或 0.001)。組織學結果表明,BCP組小鼠出現(xiàn)腫瘤生長和骨質破壞,腫瘤細胞嚴重浸潤和侵蝕骨皮質,而Sham組小鼠骨質結構基本正常。與-1 d 時比較,Sham 組小鼠 7 d、14 d 和 21 d 時 ET-1 mRNA、ETARmRNA和ETBRmRNA及蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),BCP組小鼠14d和21 d 時 ET-1 mRNA、ETAR mRNA 和 ETBR mRNA 及蛋白表達上調(P0.05、0.01或0.001),7d時差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。與Sham組比較,BCP組小鼠 7、14、21d 時 ET-1mRNA、ETARmRNA 和 ETBRmRNA 及蛋白表達上調(P0.05,0.01或0.001)。在觀察時點內,Sham組小鼠p-Akt、p-ERK-1/2表達及p-Akt/t-Akt和p-ERK-1/2/t-ERK-1/2并未見明顯變化,而BCP組小鼠上述指標呈現(xiàn)時間依賴式的表達上調。與Sham組比較,BCP組小鼠7 d、14 d和21 d時p-Akt和p-ERK-1/2表達上調,p-Akt/t-Akt和 p-ERK-1/2/t-ERK-1/2 增加(P0.05、0.01 或 0.001)。第二部分:與 Sham+NS 組、Sham+BQ-123 組、Sham+BQ-788 組比較,BCP組、BCP+NS和BCP+BQ-788組小鼠表現(xiàn)為NSF升高和PWT降低(P0.001),且痛行為學指標在鞘內注射后180min的觀察時間內基本保持不變。而鞘內注射后,BCP+BQ-123組痛行為學出現(xiàn)了“V”字型變化,表現(xiàn)為NSF在鞘內注射后0～90 min內急劇下降,90 min時達到最低點,90 min后開始急劇上升,180min時基本回復至鞘內注射前水平。PWT的變化趨勢與NSF完全相反。因此,于鞘內注射后90 min時,每組隨機選擇5只小鼠,處死后取脊髓L4-6節(jié)段,采用Westem blot 法檢測磷酸化 p-Akt、t-Akt、p-ERK-1/2 和 t-ERK-1/2 水平,并計算 p-Akt/t-Akt和 p-ERK-1/2/t-ERK-1/2。結果顯示,與 BCP 組和 BCP+NS 組比較,BCP+BQ-123組小鼠脊髓 p-Akt、p-ERK-1/2 表達下調,p-Akt/t-Akt 和 p-ERK-1/2/t-ERK-1/2 降低(P0.001)。結論第一部分:脊髓ET-1及其受體參與BCP的維持,脊髓Akt和ERK通路在BCP的形成和維持中發(fā)揮重要作用。第二部分:鞘內注射ETAR拮抗劑可能通過抑制脊髓Akt和ERK通路減輕小鼠BCP。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R614
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
符號說明
前言
研究一 脊髓內皮素-1及其受體、Akt和ERK通路在骨癌痛中的變化
    1. 研究背景
    2. 材料與方法
    3. 結果
    4. 討論
    5. 結論
研究二 鞘內注射內皮素A受體拮抗劑通過抑制脊髓Akt和ERK通路減輕對小鼠骨癌痛
    1. 研究背景
    2. 材料與方法
    3. 結果
    4. 討論
    5. 結論
附圖表
細胞培養(yǎng)及實驗室檢測流程
參考文獻
致謝
攻讀學位期間發(fā)表學術論文目錄
英文論文一
英文論文二
學位論文評閱及答辯情況表

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本文編號：2889285