第一部分成骨不全癥患兒血清骨硬化素水平研究背景成骨不全癥(osteogenesis imperfecta,OI)是臨床表型和基因型具有極高異質(zhì)性的一組單基因遺傳性骨病,以低骨量、反復(fù)骨折和骨骼畸形為主要臨床特點(diǎn)。OI診斷主要依賴分子遺傳學(xué)或臨床和影像學(xué)表現(xiàn)。目前尚缺乏OI特異的生化標(biāo)志物。OI患者存在骨基質(zhì)和成骨細(xì)胞異常,可能進(jìn)一步影響骨細(xì)胞的功能及其分泌的細(xì)胞因子。骨硬化素(sclerostin,SOST)是一種幾乎均由成熟骨細(xì)胞分泌的糖蛋白,有抑制骨形成和促進(jìn)骨吸收的作用。小樣本研究顯示SOST水平在OI中存在不一致性。SOST能否成為兒童OI特異的生化標(biāo)志物尚缺乏大樣本研究,SOST與臨床分型、基因型、雙膦酸鹽治療的相關(guān)性也值得進(jìn)一步探索。目的1.檢測OI患兒血清SOST的水平,同健康兒童比較,判斷血清SOST能否成為兒童OI特異的生化標(biāo)志物。2.比較血清SOST在不同臨床表型、基因型、雙膦酸鹽治療組間的差異,判斷血清SOST與OI疾病分型和雙膦酸鹽治療的相關(guān)性。方法1.本研究是一個橫斷面研究,納入截至2017年6月于北京協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科就診的139例臨床和基因診斷明確的OI兒童,同時納入53例門診行常規(guī)查體的年齡、性別匹配的健康對照。在OI患者中,詳細(xì)詢問患者病史、臨床表現(xiàn),進(jìn)行體格檢查、生化檢查和影像學(xué)檢查。采用羅氏電化學(xué)發(fā)光法檢測破骨指標(biāo)——β膠原降解產(chǎn)物(β-cross linked C-telopeptide of type I collagen,β-CTX)、25 羥維生素 D 和甲狀旁腺素,采用酶聯(lián)免疫標(biāo)記法檢測成骨指標(biāo)——血總堿性磷酸酶(total alkaline phosphatase,TALP)。采用雙能 X 線骨吸收儀(DXA,Lunar Prodigy,GE Healthcare,美國)檢測腰椎和股骨近端骨密度。利用自主設(shè)計的二代高通量靶向捕獲測序平臺對OI致病基因進(jìn)行檢測,并采用Sanger測序進(jìn)行驗證。2.利用酶聯(lián)免疫吸附測定方法(ELISA,BiomedicaMedizinprodukteGmbH,維也納)檢測OI患兒和健康兒童血清SOST水平,比較兩組血清SOST水平的差異。3.根據(jù)經(jīng)典的Sillence分型,將OI患兒分為Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型,其中Ⅰ型為輕型,Ⅲ型和Ⅳ型合并為中重型;基因型上,分為COL1A1突變組、COL1A2突變組、IFITM5突變組和其他罕見基因突變組(除COL1A1、COL1A2和IFITM5外的其他致病基因突變);將Ⅰ型膠原不同類型突變分為COL1A1單倍劑量不足組、COL1A1三螺旋結(jié)構(gòu)變異組、COL1A2三螺旋結(jié)構(gòu)變異組;按照是否接受雙膦酸鹽分為雙膦酸鹽治療組和非治療組,比較各組間OI患兒身高、骨折率、骨轉(zhuǎn)換生化標(biāo)志物、SOST、骨密度的差異。4.探索血清SOST與骨轉(zhuǎn)換生化標(biāo)志物、25羥維生素D、甲狀旁腺激素、骨密度和骨折率的相關(guān)性。結(jié)果1.本研究納入139例OI患兒,平均年齡為9.4±4.6歲,其中97例男性,42例女性。61例有陽性脆性骨折家族史。平均長骨骨折次數(shù)為1.00±1.02次/年。118例(84.9%)患者存在藍(lán)色或藍(lán)灰色鞏膜,30例(21.6%)患者存在牙本質(zhì)發(fā)育不全,僅3例(2.2%)患者存在明顯的聽力受損。腰椎和股骨頸骨密度Z值分別為-0.86±2.47和-2.10±3.13。2.0I患兒的血清SOST水平與健康對照間無顯著差異(25.3±9.8和25.0±5.5 pmol/l,p=0.514)。3.不同臨床分型間比較,本研究發(fā)現(xiàn)輕型OI患兒(Ⅰ型,n=78例)比中重型(Ⅲ型和Ⅳ型,n=61例)OI患兒身高更高、體重更重、腰椎和股骨頸骨密度Z值更高、雙膦酸鹽治療前骨折次數(shù)更少(p0.05)。輕型OI血清SOST水平顯著低于中重型OI(24.2±9.8和26.5±9.8pmol/l,p=0.035),但是校正年齡因素后,上述差異不顯著(p=0.160)。4.不同基因分型組間比較,本研究發(fā)現(xiàn)罕見基因突變組患者身高最矮,COL1A1突變組患者身高最高。罕見基因突變組(n=18)血清SOST水平高于健康對照(31.9±12.9和 25.0±5.5 pmol/l,p=0.018),并且高于 COL1A1(n=69)、COL1A2(n=42)和IFITM5(n=10)突變組,在校正年齡因素后,上述差異仍存在統(tǒng)計學(xué)意義。IFITM5突變組血清SOST較健康對照組有升高趨勢(29.3±9.0和25.0±5.5pmol/l,p=0.054)。5.不同I型膠原突變組間比較,發(fā)現(xiàn)COL1A1單倍劑量不足組(n=26)患者較COL1A1三螺旋結(jié)構(gòu)變異組(n=17)和COL1A2三螺旋結(jié)構(gòu)變異組(n=31)身高更高、體重更重(p0.05)。COL1A1單倍劑量不足組血清SOST水平顯著低于健康對照組(21.6±6.0和25.0±5.5p pmol/1,p=0.013),在校正年齡因素后,上述差異仍存在統(tǒng)計學(xué)意義。但是,COL1A1單倍劑量不足組與三螺旋結(jié)構(gòu)變異組無明顯差異。6.雙膦酸鹽治療組(n=61)血清β-CTX和TALP顯著低于雙膦酸鹽非治療組(n=78)(p0.001),腰椎和股骨頸骨密度Z值顯著高于雙膦酸鹽非治療組(p0.001)。血清 SOST 在兩組間無顯著差異(26.4±11.3 和 24.3±8.4pmol/l,p=0.596)。7.校正年齡、性別、雙膦酸鹽治療后,血清SOST與β-CTX呈正相關(guān)(r=0.24,p=0.006)。未發(fā)現(xiàn)血清SOST與TALP、骨密度和骨折率的相關(guān)性。結(jié)論本研究比較中國大樣本OI患兒與健康兒童血清SOST的差異,并分析不同臨床分型和基因型患者血清SOST的差異,研究發(fā)現(xiàn)不同臨床表型OI患者與健康對照組血清SOST水平無明顯差異,提示血清SOST對于鑒別OI和健康兒童,以及判斷OI嚴(yán)重程度意義有限。然而在OI患者中,罕見基因突變患者血清SOST水平高于其他突變類型患者,提示不同基因突變患者血清SOST可能存在差異,同時,高血清SOST水平有助于解釋罕見基因突變患者對雙膦酸鹽療效欠佳,這部分患者未來可以考慮骨硬化素單克隆抗體進(jìn)行治療。第二部分重癥肌無力患者骨骼損害及防治研究背景骨骼和肌肉密切相關(guān),肌肉主要通過力學(xué)作用和化學(xué)作用影響骨骼。神經(jīng)肌肉系統(tǒng)異常疾病往往出現(xiàn)肌力下降、維生素D缺乏、骨密度下降、骨折風(fēng)險增加。重癥肌無力(myastheniagravis,MG)是常見的自身免疫性神經(jīng)肌肉系統(tǒng)疾病,是研究肌肉和骨骼相互關(guān)系的疾病模型。然而,MG對骨代謝指標(biāo)的影響,MG患者肌肉和骨骼的相互關(guān)系尚不十分清楚。糖皮質(zhì)激素是MG患者最常用的免疫抑制劑,長期使用可以導(dǎo)致患者骨密度下降、骨折風(fēng)險升高。然而,MG合并骨質(zhì)疏松癥的防治十分不足。阿侖膦酸鈉和阿法骨化醇在初始糖皮質(zhì)激素的MG患者中的療效和安全性值得進(jìn)一步研究。目的1.評價未開始糖皮質(zhì)激素治療的MG患者肌肉和骨代謝指標(biāo)的異常,分析MG患者肌肉和骨骼的相互作用。2.在初始糖皮質(zhì)激素治療的MG患者中,前瞻性的觀察阿侖膦酸鈉和阿法骨化醇聯(lián)合、阿法骨化醇單藥防治骨質(zhì)疏松癥的療效和安全性。方法1.本研究納入2014年12月至2016年6月就診于北京協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科和內(nèi)分泌科的眼肌型或輕中度全身型的重癥肌無力患者,同時從中國骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)研究中選取性別、年齡匹配的健康對照。在未糖皮質(zhì)激素治療的MG患者(n=86例)和健康對照(n=86例)中,采用羅氏電化學(xué)發(fā)光法檢測破骨指標(biāo)——β膠原降解產(chǎn)物(cross-linked C-telopeptide of type Ⅰ collagen,β-CTX)、25 羥維生素 D 和甲狀旁腺素,采用酶聯(lián)免疫標(biāo)記法檢測成骨指標(biāo)——血總堿性磷酸酶(total alkaline phosphatase,TALP)。采用放射免疫法檢測成骨指標(biāo)——總骨鈣素(osteocalcin,OC)。采用雙能 X 線骨吸收儀(DXA,Lunar Prodigy,GE Healthcare,美國)檢測腰椎和股骨近端骨密度,并在兩組間比較。在MG患者中,通過電子握力計(CAMRY,EH101)檢測左右側(cè)握力。在雙眼睜開前提下,記錄患者保持單腿站立狀態(tài)的時間,即單腿站立時間,并分析上述指標(biāo)的相關(guān)性。2.初始糖皮質(zhì)激素治療的患者接受抗骨質(zhì)疏松藥物防治。按照基線骨密度T值是否低于-1.0分為阿侖膦酸鈉治療組和阿法骨化醇治療組。如果基線骨密度T值-1.0,接受阿侖膦酸鈉維D3(福美加,阿侖膦酸鈉70 mg和普通維生素D 2800IU/片)一片每周一次治療。兩組均接受鈣爾奇D1片每日一次,阿法骨化醇0.25μg/次隔日一次治療。治療3個月、6個月和12個月時對患者進(jìn)行隨訪,觀察骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)和骨密度變化,并監(jiān)測藥物相關(guān)不良反應(yīng)。結(jié)果1.與健康對照相比,MG患者存在股骨頸骨密度(p0.001)低于健康對照,25羥維生素 D 水平低于健康對照(17.36±6.64vs.22.11±7.28ng/ml,p0.001),β-CTX(p0.001)和甲狀旁腺激素(p=0.001)水平升高。2.在MG患者中,分別有11例(12.8%)和12例(14.0%)患者存在低握力和低單腿站立時間,有3例(3.5%)患者存在年齡不匹配的低骨量。在MG患者中,握力和骨密度呈正相關(guān)。3.在抗骨質(zhì)疏松癥藥物療效研究中(n=75例),治療12個月后,阿侖膦酸鈉治療組,腰椎和全髖骨密度分別增長3.4%(p=0.002)和2.6%(p=0.020)。血清OC、TALP 和β-CTX 分別較基線下降 54.5%、31.2%和 63.5%(p0.05)。4.在阿法骨化醇治療組,治療12個月,腰椎、股骨頸和全髖骨密度分別下降6.1%、3.2%和 3.3%(p0.001),血清 OC、TALP 分別下降 41.3%(p0.001)和 18.3%(p0.001),β-CTX水平無明顯變化(p=0.652)。5.阿侖膦酸鈉和阿法骨化醇的安全性良好,但高尿鈣(24UCa≥7.5mmol/24h)發(fā)生率高,阿侖膦酸鈉治療組和阿法骨化醇治療組分別有40.9%和50.9%患者出現(xiàn)至少一次高尿鈣(p=0.458)。結(jié)論本研究在中國重癥肌無力患者中評價肌肉和骨骼的相關(guān)性,及抗骨質(zhì)疏松藥物在MG患者中的療效和安全性,類似研究未見報道。我們發(fā)現(xiàn)未糖皮質(zhì)激素治療的MG患者較健康對照股骨近端骨密度降低,可能與肌肉強(qiáng)度下降、破骨指標(biāo)升高、維生素D缺乏和繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥相關(guān)。在初始糖皮質(zhì)激素治療的MG患者中,阿侖膦酸鈉聯(lián)合阿法骨化醇治療可以顯著增加骨密度、降低骨轉(zhuǎn)換生化標(biāo)志物。然而,阿法骨化醇單藥治療不能防治初始糖皮質(zhì)激素治療患者骨量丟失。藥物治療過程中需密切監(jiān)測尿鈣水平,減少藥物相關(guān)不良反應(yīng)。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R726.8;R746.1
【部分圖文】：

能通過增加護(hù)骨素的表達(dá)來增加骨量。ＳＯＳＴ可以通過結(jié)合ＬＲＰ５／６的胞外段，阻斷??Ｗｎｔ和ＦＤＺ結(jié)合，使ＧＳＫ－３Ｐ活性增加，ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ降解增多，下游成骨通路被阻斷，??起到抑制骨形成的作用（圖１－２）。此外，部分研宄提示Ｓ０ＳＴ也能通過增加骨細(xì)??胞表達(dá)核因子?ｋａｐｐａ?Ｂ?受體激活劑（ｒｅｃｅｐｔｏｒ?ａｃｔｉｖａｔｏｒ?ｏｆ?ｎｕｃｌｅａｒ?ｆａｃｔｏｒ?ｋａｐｐａ?Ｂ，??ＲＡＮＫＬ）増加破骨細(xì)胞生成、促進(jìn)骨吸收［５２］（圖１－２）。ＳＯＳＴ主要在骨骼微環(huán)??境中起作用，但是也可以分泌到血液中。因此，血清Ｓ０ＳＴ可以反映骨細(xì)胞的異常，??成為０１潛在的生化標(biāo)志物。??１９??

加入２０?ｕｌ標(biāo)準(zhǔn)品／質(zhì)控／樣品；??入５０ｕｌＡＢ，輕微混勻；??料膜覆蓋，室溫（１８－２４°Ｃ），避光孵育１８－２４小時；??加入３００?ｕｒ洗液，洗板５次，最后一次務(wù)必將板上的洗液拍凈；??入２００ｕｌＣＯＮＪ；??料膜覆蓋，室溫（１８－２４°Ｃ），避光孵育１小時；??加入３００?ｕｌ洗液，洗扳５次，最后一次務(wù)必將板上的洗液拍凈；??入２００?ｕｌ?ＳＵＢ；??（１８－２４°Ｃ），避光孵育３０分鐘；??加入５０?ｕｌ?ＳＴＯＰ；??０?ｎｍ下檢測，讀取吸光度，獲得擬合曲線，讀取樣本測得數(shù)值。??

?塊不規(guī)則小骨或多塊縫間骨大于６ｘ４?ｍｍ，形成“馬賽克”或“鋪路石”樣改變［５９］。??采用Ｇｅｎａｎｔ半定量標(biāo)準(zhǔn)（圖１－４）判斷有無椎體壓縮性骨折，０級為正常；椎體高??度降低２０－２５％——１級，輕度骨折；椎體高度降低２５－４０％——２級，中度骨折；椎??體高度降低２４０％——３級，嚴(yán)重骨折［６０］。??正常（〇級）??臟?繊??重度骨折０級）??圖１－４?Ｇｅｎａｎｔ半定量標(biāo)準(zhǔn)??２．２．４基因突變檢測??２．２．４．１提取全血ＤＮＡ??在簽署知情同意書后，使用ＥＤＴＡ真空抗凝采血管留取血樣２?ｍｌ用于ＤＮＡ提??取，按照德國ＱＩＡＧＥＮ全血ＤＮＡ提取試劑盒提取，具體操作步驟如下：??（１）
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