目的:探討下調受體相互作用蛋白激酶4(receptor interacting protein kinase4,RIPK4)基因的表達對骨肉瘤MG-63細胞凋亡的影響。同時探討下調受體相互作用蛋白激酶4(receptor interacting protein kinase 4,RIPK4)基因可能通過抑制AKT/mTOR/GSK3/NF-κB信號通路調控骨肉瘤MG-63細胞的增殖和凋亡。方法:(1)采用脂質體轉染法將特異性針對RIPK4基因的siRNA轉入骨肉瘤MG-63細胞(RIPK4-siRNA轉染組),以轉染陰性對照siRNA(negative controll RNA,NC-siRNA)作為陰性對照,同時建立TNF-α處理MG-63細胞的陽性對照組以及RIPK4-siRNA轉染MG-63細胞后再行TNF-α處理組。EdU法檢測MG-63細胞增殖情況,Hoechst 33258染色法檢測MG-63細胞凋亡情況,蛋白質印記法檢測MG-63細胞凋亡相關蛋白Bax、Bcl-xl及caspase-3表達情況。(2)采用脂質體轉染法將特異性針對RIPK4基因的siRNA轉入骨肉瘤MG-63細胞(RIPK4-siRNA轉染組),以轉染陰性對照-siRNA(negative control-RNA,NC-siRNA)作為陰性對照組,同時建立AKT抑制劑Perifosine(KRX-0401)組及空白對照組。采用免疫熒光染色法初步觀察骨肉瘤細胞中PI3K、AKT、mTOR及NF-κB蛋白的表達情況。采用蛋白質印跡法檢測骨肉瘤MG-63細胞中RIPK4、PI3K、AKT、mTOR、Gsk3β及NF-κB蛋白的表達情況。采用蛋白質印跡法檢測骨肉瘤MG-63細胞中細胞周期調節(jié)蛋白p53、p21及抗凋亡蛋白Bcl-2,促凋亡蛋白Bad的表達情況。結果:(1)RIPK4-siRNA轉染MG-63細胞后,RIPK4蛋白的表達水平明顯下調(P0.05)。EdU法檢測結果顯示,RIPK4-siRNA轉染組、NC-siRNA轉染組、TNF-α陽性對照組和RIPK4-siRNA轉染+TNF-α組細胞的EdU陽性表達率分別為60.7%、39.6%、43.3%和16.7%,RIPK4-siRNA轉染組細胞的增殖能力較RIPK4-siRNA轉染組明顯降低(P0.05),RIPK4-siRNA轉染+TNF-α組細胞的增殖能力較RIPK4-siRNA轉染組和TNF-α陽性對照組明顯降低(P值均0.05)。Hoechst 33258染色結果顯示,RIPK4-siRNA轉染組發(fā)生凋亡的細胞數(shù)較NC-siRNA轉染組增多(P0.05),RIPK4-siRNA轉染+TNF-α組發(fā)生凋亡的細胞數(shù)較RIPK4-siRNA轉染組和TNF-α陽性對照組明顯增多(P值均0.05)。沉默RIPK4基因后Bax蛋白和caspase-3蛋白表達水平增高,Bcl-xl蛋白表達水平下調,與NC-siRNA組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P值均0.05);RIPK4-siRNA轉染+TNF-α組中Bax蛋白和caspase-3蛋白表達水平均較RIPK4-siRNA轉染組和TNF-α陽性對照組上調,Bcl-xl蛋白的表達水平下調,差異具有統(tǒng)計學意義(P值均0.05)。(2)免疫熒光染色法檢測顯示:與空白對照組、NC-siRNA組相比,RIPK4-siRNA轉染MG-63細胞后PI3K蛋白表達變化無明顯變化,AKT及mTOR蛋白的變化下調,NF-κB蛋白在細胞核中的表達上調。進一步用蛋白質印跡法檢測結果顯示:與空白對照組、NC-siRNA組相比,RIPK4-siRNA轉染組MG-63細胞中RIPK4蛋白的表達量明顯下調(P0.05);與空白對照組、NC-siRNA組相比,RIPK4-siRNA轉染組MG-63細胞中PIK3蛋白的表達并無明顯的變化;與空白對照組、NC-siRNA組相比,RIPK4-siRNA轉染組及Akt抑制劑Perifosine(KRX-0401)MG-63細胞中Akt、mTOR蛋白的表達量明顯下調,有顯著的統(tǒng)計學意義(#P0.05)。與空白對照組、NC-siRNA組相比,RIPK4-siRNA轉染組及Akt抑制劑Perifosine(KRX-0401)MG-63細胞中GSK3β蛋白蛋白的表達顯著上調(P0.05),NF-κB蛋白的表達顯著下調(P0.05)。同時發(fā)現(xiàn)Akt抑制劑Perifosine(KRX-0401)對RIPK4蛋白的表達并無明顯影響,沒有統(tǒng)計學意義(*P0.05);RIPK4-siRNA轉染組與Akt抑制劑Perifosine(KRX-0401)組相比骨肉瘤細胞中Akt蛋白的表達上調(*P0.05),但NF-κB蛋白的表達量則明顯下調(P0.05)。RIPK4-siRNA轉染組和Akt抑制劑Perifosine(KRX-0401)干擾組與空白對照組、NC-siRNA組相比中細胞周期調節(jié)蛋白p53、p21和促凋亡蛋白Bad的表達上調(P0.05),而抗凋亡蛋白Bcl-2則下調(P0.05)。結論:下調RIPK4基因表達可誘導骨肉瘤MG-63細胞發(fā)生凋亡,并且可以促進TNF-α誘導細胞發(fā)生凋亡。RIPK4基因可能通過AKT/mTOR/GSK3/NF-κB信號通路調控骨肉瘤MG-63細胞的增殖和凋亡。
【學位單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R738.1
【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 骨肉瘤的特點與現(xiàn)狀
        1.1.1 骨肉瘤的特征
        1.1.2 骨肉瘤的臨床特點及預后
        1.1.3 骨肉瘤的臨床治療現(xiàn)狀
    1.2 RIPK4基因的功能
        1.2.1 RIPK4基因概述
        1.2.2 RIPK4基因在正常組織中的生物學功能
        1.2.3 RIPK4與腫瘤之間的關系
        1.2.4 RIPK4與細胞通路的關系
第二章 下調RIPK4基因表達增強TNF-α誘導細胞凋亡的敏感性
    2.1 實驗材料
        2.1.1 細胞系來源
        2.1.2 主要實驗儀器
        2.1.3 主要實驗試劑
        2.1.4 配制相關實驗溶液
    2.2 實驗方法
        2.2.1 細胞培養(yǎng)及傳代
        2.2.2 凍存和復蘇細胞
        2.2.3 細胞的siRNA轉染
        2.2.4 蛋白質印跡法檢測MG-63細胞中RIPK4蛋白的表達情況
        2.2.5 Hoechst33258染色法觀察細胞凋亡
        2.2.6 5-乙炔基-2’-脫氧尿苷（5-ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU）法檢測MG-63細胞增殖
        2.2.7 蛋白質印跡法檢測凋亡相關蛋白的表達
        2.2.8 統(tǒng)計學方法
    2.3 實驗結果
        2.3.1 RIPK4-siRNA下調MG-63細胞中RIPK4蛋白的表達
        2.3.2 沉默RIPK4基因表達可抑制MG-63細胞增殖
        2.3.3 沉默RIPK4基因表達以及聯(lián)合TNF-α對MG-63細胞凋亡的影響
        2.3.4 沉默RIPK4基因表達以及聯(lián)合TNF-α對MG-63細胞中Bax、Bcl-xL及caspase-3蛋白表達的影響
    2.4 討論
第三章 RIPK4可能通過抑制AKT/mTOR/GSK3/NF-κB信號通路調控骨肉瘤MG-63細胞的增值和凋亡
    3.1 實驗材料
        3.1.1 細胞系來源
        3.1.2 主要實驗儀器
        3.1.3 主要實驗試劑
    3.2 實驗方法
        3.2.1 細胞復蘇、培養(yǎng)與傳代
        3.2.2 細胞siRNA轉染
        3.2.3 免疫熒光染色法初步觀察下調RIPK4基因后骨肉瘤細胞中PI3K、AKT、mTOR及NF-κB蛋白的表達情況
        3.2.4 蛋白質印跡法檢測細胞中PI3K、AKT、mTOR、GSK3β及NF-κB蛋白的表達情況
        3.2.5 蛋白質印跡法檢測細胞周期調控蛋白p21、p53和凋亡相關蛋白Bcl-2、Bad的表達
        3.2.6 統(tǒng)計學方法
    3.3 結果
        3.3.1 RIPK4-siRNA下調MG-63細胞中AKT、mTOR蛋白的表達并上調NF-κB蛋白在細胞核中的表達
        3.3.2 RIPK4-siRNA影響AKT/mTOR/GSK3β/NF-κB信號通路相關蛋白的表達
        3.3.3 RIPK4-siRNA可能通過AKT/mTOR/GSK3β/NF-κB信號通路調控骨肉瘤MG-63細胞的增值和凋亡
    3.4 討論
第四章 結論
    4.1 主要結論
    4.2 研究展望
參考文獻
英文縮略詞
在學期間的研究成果
致謝

【參考文獻】

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本文編號：2885619