發(fā)布時(shí)間：2020-11-16 04:27

　　 目的:探討下調(diào)受體相互作用蛋白激酶4(receptor interacting protein kinase4,RIPK4)基因的表達(dá)對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞凋亡的影響。同時(shí)探討下調(diào)受體相互作用蛋白激酶4(receptor interacting protein kinase 4,RIPK4)基因可能通過(guò)抑制AKT/mTOR/GSK3/NF-κB信號(hào)通路調(diào)控骨肉瘤MG-63細(xì)胞的增殖和凋亡。方法:(1)采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將特異性針對(duì)RIPK4基因的siRNA轉(zhuǎn)入骨肉瘤MG-63細(xì)胞(RIPK4-siRNA轉(zhuǎn)染組),以轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA(negative controll RNA,NC-siRNA)作為陰性對(duì)照,同時(shí)建立TNF-α處理MG-63細(xì)胞的陽(yáng)性對(duì)照組以及RIPK4-siRNA轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞后再行TNF-α處理組。EdU法檢測(cè)MG-63細(xì)胞增殖情況,Hoechst 33258染色法檢測(cè)MG-63細(xì)胞凋亡情況,蛋白質(zhì)印記法檢測(cè)MG-63細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-xl及caspase-3表達(dá)情況。(2)采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將特異性針對(duì)RIPK4基因的siRNA轉(zhuǎn)入骨肉瘤MG-63細(xì)胞(RIPK4-siRNA轉(zhuǎn)染組),以轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照-siRNA(negative control-RNA,NC-siRNA)作為陰性對(duì)照組,同時(shí)建立AKT抑制劑Perifosine(KRX-0401)組及空白對(duì)照組。采用免疫熒光染色法初步觀(guān)察骨肉瘤細(xì)胞中PI3K、AKT、mTOR及NF-κB蛋白的表達(dá)情況。采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)骨肉瘤MG-63細(xì)胞中RIPK4、PI3K、AKT、mTOR、Gsk3β及NF-κB蛋白的表達(dá)情況。采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)骨肉瘤MG-63細(xì)胞中細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白p53、p21及抗凋亡蛋白Bcl-2,促凋亡蛋白Bad的表達(dá)情況。結(jié)果:(1)RIPK4-siRNA轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞后,RIPK4蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)(P0.05)。EdU法檢測(cè)結(jié)果顯示,RIPK4-siRNA轉(zhuǎn)染組、NC-siRNA轉(zhuǎn)染組、TNF-α陽(yáng)性對(duì)照組和RIPK4-siRNA轉(zhuǎn)染+TNF-α組細(xì)胞的EdU陽(yáng)性表達(dá)率分別為60.7%、39.6%、43.3%和16.7%,RIPK4-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖能力較RIPK4-siRNA轉(zhuǎn)染組明顯降低(P0.05),RIPK4-siRNA轉(zhuǎn)染+TNF-α組細(xì)胞的增殖能力較RIPK4-siRNA轉(zhuǎn)染組和TNF-α陽(yáng)性對(duì)照組明顯降低(P值均0.05)。Hoechst 33258染色結(jié)果顯示,RIPK4-siRNA轉(zhuǎn)染組發(fā)生凋亡的細(xì)胞數(shù)較NC-siRNA轉(zhuǎn)染組增多(P0.05),RIPK4-siRNA轉(zhuǎn)染+TNF-α組發(fā)生凋亡的細(xì)胞數(shù)較RIPK4-siRNA轉(zhuǎn)染組和TNF-α陽(yáng)性對(duì)照組明顯增多(P值均0.05)。沉默RIPK4基因后Bax蛋白和caspase-3蛋白表達(dá)水平增高,Bcl-xl蛋白表達(dá)水平下調(diào),與NC-siRNA組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均0.05);RIPK4-siRNA轉(zhuǎn)染+TNF-α組中Bax蛋白和caspase-3蛋白表達(dá)水平均較RIPK4-siRNA轉(zhuǎn)染組和TNF-α陽(yáng)性對(duì)照組上調(diào),Bcl-xl蛋白的表達(dá)水平下調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均0.05)。(2)免疫熒光染色法檢測(cè)顯示:與空白對(duì)照組、NC-siRNA組相比,RIPK4-siRNA轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞后PI3K蛋白表達(dá)變化無(wú)明顯變化,AKT及mTOR蛋白的變化下調(diào),NF-κB蛋白在細(xì)胞核中的表達(dá)上調(diào)。進(jìn)一步用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組、NC-siRNA組相比,RIPK4-siRNA轉(zhuǎn)染組MG-63細(xì)胞中RIPK4蛋白的表達(dá)量明顯下調(diào)(P0.05);與空白對(duì)照組、NC-siRNA組相比,RIPK4-siRNA轉(zhuǎn)染組MG-63細(xì)胞中PIK3蛋白的表達(dá)并無(wú)明顯的變化;與空白對(duì)照組、NC-siRNA組相比,RIPK4-siRNA轉(zhuǎn)染組及Akt抑制劑Perifosine(KRX-0401)MG-63細(xì)胞中Akt、mTOR蛋白的表達(dá)量明顯下調(diào),有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(#P0.05)。與空白對(duì)照組、NC-siRNA組相比,RIPK4-siRNA轉(zhuǎn)染組及Akt抑制劑Perifosine(KRX-0401)MG-63細(xì)胞中GSK3β蛋白蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)(P0.05),NF-κB蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)(P0.05)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)Akt抑制劑Perifosine(KRX-0401)對(duì)RIPK4蛋白的表達(dá)并無(wú)明顯影響,沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P0.05);RIPK4-siRNA轉(zhuǎn)染組與Akt抑制劑Perifosine(KRX-0401)組相比骨肉瘤細(xì)胞中Akt蛋白的表達(dá)上調(diào)(*P0.05),但NF-κB蛋白的表達(dá)量則明顯下調(diào)(P0.05)。RIPK4-siRNA轉(zhuǎn)染組和Akt抑制劑Perifosine(KRX-0401)干擾組與空白對(duì)照組、NC-siRNA組相比中細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白p53、p21和促凋亡蛋白Bad的表達(dá)上調(diào)(P0.05),而抗凋亡蛋白Bcl-2則下調(diào)(P0.05)。結(jié)論:下調(diào)RIPK4基因表達(dá)可誘導(dǎo)骨肉瘤MG-63細(xì)胞發(fā)生凋亡,并且可以促進(jìn)TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。RIPK4基因可能通過(guò)AKT/mTOR/GSK3/NF-κB信號(hào)通路調(diào)控骨肉瘤MG-63細(xì)胞的增殖和凋亡。
【學(xué)位單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R738.1
【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 骨肉瘤的特點(diǎn)與現(xiàn)狀
        1.1.1 骨肉瘤的特征
        1.1.2 骨肉瘤的臨床特點(diǎn)及預(yù)后
        1.1.3 骨肉瘤的臨床治療現(xiàn)狀
    1.2 RIPK4基因的功能
        1.2.1 RIPK4基因概述
        1.2.2 RIPK4基因在正常組織中的生物學(xué)功能
        1.2.3 RIPK4與腫瘤之間的關(guān)系
        1.2.4 RIPK4與細(xì)胞通路的關(guān)系
第二章 下調(diào)RIPK4基因表達(dá)增強(qiáng)TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的敏感性
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 細(xì)胞系來(lái)源
        2.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器
        2.1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑
        2.1.4 配制相關(guān)實(shí)驗(yàn)溶液
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代
        2.2.2 凍存和復(fù)蘇細(xì)胞
        2.2.3 細(xì)胞的siRNA轉(zhuǎn)染
        2.2.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)MG-63細(xì)胞中RIPK4蛋白的表達(dá)情況
        2.2.5 Hoechst33258染色法觀(guān)察細(xì)胞凋亡
        2.2.6 5-乙炔基-2’-脫氧尿苷（5-ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU）法檢測(cè)MG-63細(xì)胞增殖
        2.2.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)
        2.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 RIPK4-siRNA下調(diào)MG-63細(xì)胞中RIPK4蛋白的表達(dá)
        2.3.2 沉默RIPK4基因表達(dá)可抑制MG-63細(xì)胞增殖
        2.3.3 沉默RIPK4基因表達(dá)以及聯(lián)合TNF-α對(duì)MG-63細(xì)胞凋亡的影響
        2.3.4 沉默RIPK4基因表達(dá)以及聯(lián)合TNF-α對(duì)MG-63細(xì)胞中Bax、Bcl-xL及caspase-3蛋白表達(dá)的影響
    2.4 討論
第三章 RIPK4可能通過(guò)抑制AKT/mTOR/GSK3/NF-κB信號(hào)通路調(diào)控骨肉瘤MG-63細(xì)胞的增值和凋亡
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 細(xì)胞系來(lái)源
        3.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器
        3.1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)與傳代
        3.2.2 細(xì)胞siRNA轉(zhuǎn)染
        3.2.3 免疫熒光染色法初步觀(guān)察下調(diào)RIPK4基因后骨肉瘤細(xì)胞中PI3K、AKT、mTOR及NF-κB蛋白的表達(dá)情況
        3.2.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞中PI3K、AKT、mTOR、GSK3β及NF-κB蛋白的表達(dá)情況
        3.2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白p21、p53和凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bad的表達(dá)
        3.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 RIPK4-siRNA下調(diào)MG-63細(xì)胞中AKT、mTOR蛋白的表達(dá)并上調(diào)NF-κB蛋白在細(xì)胞核中的表達(dá)
        3.3.2 RIPK4-siRNA影響AKT/mTOR/GSK3β/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)
        3.3.3 RIPK4-siRNA可能通過(guò)AKT/mTOR/GSK3β/NF-κB信號(hào)通路調(diào)控骨肉瘤MG-63細(xì)胞的增值和凋亡
    3.4 討論
第四章 結(jié)論
    4.1 主要結(jié)論
    4.2 研究展望
參考文獻(xiàn)
英文縮略詞
在學(xué)期間的研究成果
致謝

【參考文獻(xiàn)】

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