研究目的:下腰痛為困擾當(dāng)代中老年人乃至年輕人的重要疾患,其每年給國家?guī)砭薮蟮慕?jīng)濟(jì)損失以及社會(huì)負(fù)擔(dān)。目前認(rèn)為下腰痛的主要病因?yàn)樽甸g盤退變,椎間盤退變?cè)谂R床上很常見,其主要表現(xiàn)為椎間盤含水量降低,椎間高度降低;椎間盤含水量的決定分子為其基質(zhì)成分內(nèi)的硫酸軟骨素,硫酸軟骨素的合成由多種合成酶催化,但其在椎間盤退變中的作用鮮有研究。硫酸軟骨素已被發(fā)現(xiàn)在椎間盤退變中表達(dá)降低,但其調(diào)控機(jī)制尚不清楚,目前大量研究提示炎癥因子與椎間盤基質(zhì)代謝密切相關(guān),我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示促炎因子白細(xì)胞介素-1β可直接下調(diào)硫酸軟骨素的合成,而抗炎因子轉(zhuǎn)化生長因子-β則促進(jìn)硫酸軟骨素合成,我們進(jìn)一步假設(shè)該調(diào)節(jié)作用可能是通過其對(duì)硫酸軟骨素合酶的調(diào)控實(shí)現(xiàn),闡明該調(diào)控機(jī)制有助于在其中尋找相關(guān)治療靶點(diǎn),從而籍此提高椎間盤硫酸軟骨素的合成水平,恢復(fù)退變椎間盤的含水量,從而延緩甚至逆轉(zhuǎn)椎間盤退變的進(jìn)程。研究方法:該項(xiàng)目在組織層面使用免疫組織化學(xué)法及quantitive real-time PCR(RT-PCR)法檢測(cè)硫酸軟骨素合酶的表達(dá)水平,使用免疫熒光法以及DMMB法檢測(cè)硫酸軟骨素的水平,使用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序法檢測(cè)潛在microRNA靶點(diǎn)。細(xì)胞層面使用大鼠及人髓核細(xì)胞作為研究對(duì)象,使用RT-PCR法、Western-Blot法以及雙熒光素酶報(bào)告基因法在不同維度檢測(cè)硫酸軟骨素合酶的表達(dá)水平,使用免疫熒光法檢測(cè)髓核細(xì)胞硫酸軟骨素合酶表達(dá)的位置及水平,使用搭載不同干擾shRNA的慢病毒載體轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞,WesternBlot法以及雙熒光素酶報(bào)告基因法檢測(cè)其中不同信號(hào)通路蛋白的活化水平。研究結(jié)果:該研究發(fā)現(xiàn)抗炎因子TGF-β在上調(diào)大鼠髓核細(xì)胞CHSY-1以及CHPF的水平,TGF-β對(duì)CHSY-1的調(diào)控部分依賴經(jīng)典的Smad信號(hào)通路,其主要通過AP1、SP1以及MAPK通路對(duì)CHSY-1起調(diào)控作用,使用慢病毒載體敲除大鼠髓核細(xì)胞CHSY-1可降低髓核細(xì)胞以及TGF-β誘導(dǎo)下的髓核細(xì)胞合成硫酸軟骨素;TGF-β可通過經(jīng)典Smad通路上調(diào)CHPF的表達(dá),MAPK通路以及RhoA/ROCK1信號(hào)也參與了TGF-β誘導(dǎo)的CHPF表達(dá)。使用慢病毒載體敲除大鼠髓核細(xì)胞CHPF也可降低髓核細(xì)胞以及TGF-β誘導(dǎo)下的髓核細(xì)胞合成硫酸軟骨素。以上結(jié)果提示CHSY-1以及CHPF對(duì)髓核細(xì)胞硫酸軟骨素的合成起關(guān)鍵作用。但通過對(duì)人退變髓核組織CHSY-1、CHPF以及TGF-β的關(guān)系進(jìn)行分析后,發(fā)現(xiàn)CHSY-1以及CHPF表達(dá)降低,同時(shí)伴隨TGF-β高表達(dá)。提示在椎間盤退變過程中CHSY-1以及CHPF的調(diào)節(jié)還有其他機(jī)制參與。我們進(jìn)一步關(guān)注了促炎因子IL-1β對(duì)硫酸軟骨素合酶家族的調(diào)控,發(fā)現(xiàn)IL-1β可下調(diào)CHSY-1,2,3的表達(dá),且IL-1β在退變髓核組織中高表達(dá),該結(jié)果提示IL-1β在退變環(huán)境下對(duì)硫酸軟骨素合酶的調(diào)控相較于TGF-β占主導(dǎo)地位,通過microRNA高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,發(fā)現(xiàn)IL-1β對(duì)CHSYs家族基因的調(diào)節(jié)以及髓核細(xì)胞硫酸軟骨素的合成依賴microRNA-194以及microRNA-515,該研究結(jié)果提示microRNAs參與促炎因子對(duì)硫酸軟骨素及其合酶的調(diào)控。研究結(jié)論:椎間盤退變中硫酸軟骨素含量降低為髓核組織含水量降低的重要原因,硫酸軟骨素合酶家族基因在椎間盤退變中表達(dá)顯著降低可能為導(dǎo)致硫酸軟骨素含量降低的重要原因。促炎因子IL-1β及抗炎因子TGF-β均參與對(duì)硫酸軟骨素合酶家族基因的調(diào)控,促炎-抗炎平衡失調(diào)可能為硫酸軟骨素家族基因在椎間盤退變中顯著下調(diào)以及硫酸軟骨素合成降低的重要原因。MAPK、Smad、RhoA/ROCK信號(hào)介導(dǎo)抗炎因子對(duì)硫酸軟骨素合酶基因的調(diào)控,椎間盤退變中這些通路在促炎因子作用下的應(yīng)答改變可能為TGF-β對(duì)硫酸軟骨素合酶調(diào)控失偶聯(lián)的重要原因。促炎因子IL-β可顯著降低硫酸軟骨素合酶基因的表達(dá)以及硫酸軟骨素的合成,且該調(diào)節(jié)過程依賴于microRNA-194以及micro-RNA-515的參與,通過對(duì)以上調(diào)控機(jī)制的闡明,為未來尋找椎間盤退變生物治療中的潛在治療靶點(diǎn)提供了新的科學(xué)依據(jù)。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R681.5
【部分圖文】：

- 26 -圖 1 TGF-β在大鼠髓核細(xì)胞正調(diào)節(jié) CHSY-1 的表達(dá)前期研究已有報(bào)道指出 TGF-β可誘導(dǎo)髓核細(xì)胞硫酸軟骨素蛋白聚糖的合成。CHSY-1 為硫酸軟骨素蛋白聚糖骨干糖鏈延長過程的重要合酶。為檢測(cè) CHSY-1 的表達(dá)是否接受 TGF-β的調(diào)節(jié)，我們使用 TGF-β對(duì)大鼠髓核細(xì)胞進(jìn)行刺激。結(jié)果顯示，CHSY-1 的mRNA 水平及蛋白水平在 TGF-β的作用下顯著上升，從時(shí)間梯度實(shí)驗(yàn)可以看出，TGF-β對(duì) CHSY-1 的誘導(dǎo)作用在 4 小時(shí)已可被檢測(cè)到，而在 24 小時(shí)達(dá)到高峰（圖 1A 和圖1B），該結(jié)果提 TGF-β對(duì) CHSY-1 的調(diào)節(jié)存在時(shí)間依賴性；此外，通過濃度梯度實(shí)驗(yàn)可以看出，不同濃度的 TGF-β均可上調(diào) CHSY-1 的表達(dá)，并隨著 TGF-β濃度的上升，該刺激作用逐漸增強(qiáng)，該結(jié)果提示 TGF-β對(duì) CHSY-1 的刺激也存在濃度依賴性（圖 1C 和圖 1D）。進(jìn)一步通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TGF-β誘導(dǎo)的 CHSY-1 的表達(dá)亞細(xì)胞定位位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，并且熒光強(qiáng)度在 TGF-β的刺激組顯著增強(qiáng)，證實(shí)了提示 CHSY-1 接受 TGF-β的調(diào)節(jié)；為驗(yàn)證該調(diào)控作用是否在轉(zhuǎn)錄水平起效，我們使用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)?

1. 材料同上2. 方法2.1 實(shí)驗(yàn)方法同上2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式呈現(xiàn)，每次實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行了三次獨(dú)立的重復(fù)，每 次 實(shí) 驗(yàn) 中 的 每 個(gè) 實(shí) 驗(yàn) 組 均 設(shè) 置 三 次 重 復(fù) 。 數(shù) 據(jù) 的 正 態(tài) 性 檢 驗(yàn) 使 用D'Agostino & Pearson omnibus normality 檢驗(yàn)。不滿足正態(tài)分布的數(shù)據(jù)使用 Two-tailedMann-Whitney U 檢驗(yàn)。Two-tailed Student T 檢驗(yàn)用于分析兩組間差異的顯著性。OnewayANOVA以及Bonferronipost-hoc檢驗(yàn)用于分析多組間差異的顯著性。GraphpadPrismv6.0 為用于統(tǒng)計(jì)分析的軟件。P<0.05 則認(rèn)定組間的差異具有顯著性。3. 結(jié)果

節(jié)作用1. 材料同上2. 方法2.1 實(shí)驗(yàn)方法同上2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式呈現(xiàn)，每次實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行了三次獨(dú)立的重復(fù)，每 次 實(shí) 驗(yàn) 中 的 每 個(gè) 實(shí) 驗(yàn) 組 均 設(shè) 置 三 次 重 復(fù) 。 數(shù) 據(jù) 的 正 態(tài) 性 檢 驗(yàn) 使 用D'Agostino & Pearson omnibus normality 檢驗(yàn)。不滿足正態(tài)分布的數(shù)據(jù)使用 Two-taileMann-Whitney U 檢驗(yàn)。Two-tailed Student T 檢驗(yàn)用于分析兩組間差異的顯著性。OnewayANOVA以及Bonferronipost-hoc檢驗(yàn)用于分析多組間差異的顯著性。GraphpadPrismv6.0 為用于統(tǒng)計(jì)分析的軟件。P<0.05 則認(rèn)定組間的差異具有顯著性。3. 結(jié)果
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